Biologická dostupnost železa a zinku z biologicky obohacených brambor

Typ studie a populace Dvojitě zaslepená randomizovaná studie přirozeně biofortifikovaných brambor, která bude provedena v Huancavelica, Peru. Bude přijato asi 100 žen a 80 mužů ve věku 18-45 let žijících ve městě Huancavelica.

Etické žádosti byly předloženy a schváleny výborem pro etiku výzkumu (REC) Lékařské a zdravotní fakulty (FMH) University of East Anglia v Norwichi (UK) a REC Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) v Peru.

Každý účastník bude plně informován o všech postupech a bude mu poskytnuta příležitost klást otázky a získat další podrobnosti, které účastníci požadují.

Jednotlivcům, kteří souhlasí s účastí na úvodním screeningu, budou vysvětleny postupy (odběry krve, moči, antropometrie, stažení ze stravy) a účastníci budou vyzváni k podpisu prvního formuláře souhlasu.

SPECIFICKÉ METODY PRO STUDII ŽELEZA (1. fáze) Velikost vzorku Studie vyžaduje zapsání celkem 30 žen, aby 33 % žen, které nedodržují protokol, mohlo dosáhnout konečné velikosti vzorku 20 žen. Vyšetřovatelé odhadují, že vyšetřovatelé možná budou muset vyšetřit asi 100 žen.

Nutriční stav V rámci screeningu budou všichni potenciální kandidáti zváženi a měřeni pomocí standardizovaného vybavení.

Měření fyzické aktivity Všichni účastníci budou požádáni, aby použili aktigraf (tříosý akcelerometr), který měří fyzickou aktivitu (pohyb) ve třech rozměrech.

Vzorek krve Příslušně vyškolený člen studijního týmu odebere vzorek žilní krve (přibližně 6 ml do zkumavky s heparinem) k měření feritinu, hemoglobinu a CRP (screening a ještě 3krát: výchozí stav, 16 a 40 dní po prvním dni příjmu brambor).

Vzorek moči Účastníci budou požádáni, aby poskytli vzorek moči (30 ml) k provedení těhotenského testu pomocí testovacího proužku.

Sociodemografický průzkum a průzkum potravinové bezpečnosti Vyšetřovatelé zahrnou socioekonomický průzkum a dotazník ELCSA pro bezpečnost potravin, oba budou aplikovány na všechny zapsané účastníky.

Postupy studie Podle výsledků screeningu a revize kritérií pro zařazení a vyloučení a po informacích a ověření, že účastníci rozumí formuláři souhlasu se studiem železa, budou subjekty pozvány k účasti. Účastníci budou náhodně přiřazeni ke konzumaci jednoho nebo druhého ze dvou druhů brambor (biofortifikované-A nebo ne-B). První odrůda brambor bude podávána během prvních 2 týdnů (den 1-12) a druhá sekvence mezi dny 15-26 (v obou případech kromě víkendových dnů sobota a neděle). Brambory se budou vařit ve vodě a nabízet šťouchané.

Vzorky krve budou odebrány při 5 příležitostech, 1) při screeningu k ověření souladu s kritérii vyloučení a zařazení; poté 1. den před tím, než účastníci snědí první druh brambor, 15. den před konzumací druhého druhu brambor, 26. den po snězení všech obou druhů brambor a 40. den dva týdny po snězení všech brambor.

Konzumace brambor Každý účastník dostane 500 g brambor rozdělených na dvě porce po 250 g. každý účastník si vezme, v závislosti na přidělení, 0,3 mg 57FeSO4 (brambory Peruanita) nebo 0,3 mg 58FeSO4 (biofortifikované brambory), zředěné v 50 ml destilované vody, které by se měly vypít, zatímco účastníci jedí brambory - v polovině jídlo. Každý účastník navíc dostane 200 ml destilované vody k pití. Izotopy poskytne ETH (Švýcarský federální technologický institut v Curychu). Navíc izotopy, které budou vyšetřovatelé používat, jsou stabilní izotopy, to znamená, že účastníci přirozeně existují v prostředí a jako takové nepředstavují žádné riziko.

Odběr biologických vzorků pro měření železa pomocí stabilních izotopů Vzorky krve budou odebírány po celou dobu intervence, jak bylo popsáno výše, a budou odeslány do ETH v Curychu podle standardních operačních postupů. Účastníci budou informováni a poskytnou souhlas s přenosem a použitím jejich vzorků mimo Peru pro účely této výzkumné studie. Vzorky budou anonymizovány a nebudou přepravovány s osobními údaji.

Z hlediska zpracování budou vzorky smíchány s NO3 a H2O2 a natráveny v mikrovlnné troubě s následnou separací železa z krevní matrice výměnnou aniontovou chromatografií a rozpouštědlem (ředidlem) nebo extrakcí z rozpouštědla destilací.

Izotopy budou analyzovány pomocí plazmového indukčního multikolektorového hmotnostního spektrometru (Neptune; Thermo Finnigan). Množství značených izotopů železa 57Fe a 58Fe bude měřeno 14 dní po ukončení konzumace obou druhů brambor. Výpočet (absorpce) bude proveden s ohledem na odhadovaný objem krve subjektů na základě hmotnosti, výšky a naměřené koncentrace hemoglobinu u subjektu (s ohledem na průměr počátečního a konečného vzorku krve). Výpočet je založen na principu izotopového ředění uvažovaného jako faktor pro izotopový marker železa spíše než monoizotopový marker8. Pro výpočet absorbované frakce vědci předpokládají 80% začlenění absorbovaného železa.

SPECIFICKÉ METODY PRO STUDII ZINKU (Fáze 2) Velikost vzorku Studie vyžaduje velikost vzorku 40 žen. To umožňuje 40% ztrátu na dosažení konečného celkového počtu 24 žen.

Postupy Podle výsledků screeningu a po kontrole, že účastníci splňují všechna zařazovací kritéria a žádné z vylučovacích kritérií nebudou účastníci pozváni k účasti na zinkové části studie. Tento účastník obdrží druhý formulář souhlasu k přečtení a ti, kteří přijmou a podepíší formulář, budou pozváni k účasti ve studii.

Lidé, kteří přijmou, budou náhodně přiděleni ke konzumaci jednoho nebo druhého typu brambor (biofortifikované-A nebo ne-B). Všichni účastníci dostanou oba druhy brambor, ale v jiném pořadí, takže každý účastník bude mít vlastní kontrolu. První odrůda brambor bude vydána 1. den po přijetí účasti ve studii a po přijetí a podepsání formuláře souhlasu pro tuto část: (konzumní protokol a druhá odrůda budou konzumovány 29 dní poté (pořadí odrůd brambor budou přiděleny náhodně).

Vyšetřovatelé odeberou vzorky krve při třech příležitostech: při zápisu a 1. a 29. den (dny, kdy účastníci jedí brambory) po 8hodinovém půstu (jídlo) a 6 hodinách (tekutiny).

Měření studie Antropometrie V rámci screeningu budou všichni potenciální kandidáti zváženi a měřeni pomocí standardizovaného vybavení. Podle jejich hmotnosti a BMI vyšetřovatelé rozhodnou, zda jsou účastníci způsobilí.

Odsouhlasení účastníci budou požádáni o poskytnutí vzorku žilní krve (cca 10 ml ve zkumavce s heparinem). Ze vzorků krve budou odebrány plazma a erytrocyty a uloženy při teplotě <18oC.

Vzorek moči Účastníci se souhlasem poskytnou vzorek moči (30 ml) jako součást screeningové fáze k provedení těhotenského testu. Ve dnech 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 a 36 budou vyšetřovatelé odebírat vzorky moči k analýze obsahu zinku. Každý den vyšetřovatelé potřebují 100 ml moči odebrané ráno (mezi 7-12 hodinou ráno).

Konzumace brambor Pokusným osobám bude podáno celkem 1000 g brambor ve dvou 500g porcích. První porce bude podávána nalačno (nejméně 8 hodin na jídlo a 6 hodin na pití) a ve dvou samostatných porcích (každá 250 g). Když účastníci snědí první porci 250 g, dostane subjekt 0,25 mg 67Zn zředěného v 50 ml balené vody a poté účastníci dostanou druhou porci brambor. O dvě hodiny později dostanou účastníci intravenózní infuzi 70Zn (200 ug) zředěnou v 50 ml balené vody. Po dalších 2 hodinách účastníci obdrží druhé dvě porce brambor a stejně jako dříve po první porci účastníci dostanou 0,25 mg 67Zn zředěného v 50 ml balené vody. Během této doby a 3 hodiny po druhé porci brambor nebude subjekt konzumovat žádné jídlo ani tekutiny, kromě vody, která bude účastníkům poskytnuta. Každý subjekt dostane 200 ml vody s každým jídlem a 200 ml vody mezi jídly. V současné době je použití izotopů nejlepší metodou pro měření absorpce zinku. Navíc izotopy, které budou použity, jsou stabilní izotopy, to znamená, že účastníci přirozeně existují v prostředí a nepředstavují žádné riziko. Minimálně 3 hodiny po konzumaci poslední porce brambor nesmíte konzumovat žádné jídlo ani pití.

Vzorky krve pro měření zinku Vyšetřovatelé odeberou celkem tři vzorky krve. Absorpce pomocí stabilních izotopů (29. den) Vzorky krve, které byly odebrány, budou odeslány do ETH, Curych. ETH provede analýzu CRP pro zinek. CRP bude měřeno pomocí soupravy ELISA. Plazmatická koncentrace zinku bude měřena hmotnostní spektrometrií s indukční plazmou.

Vzorky moči pro měření zinku pomocí stabilních izotopů Vzorky moči budou koncentrovány pomocí lyofilizace a následně mineralizovány digescí v mikrovlnné troubě (MLS-Turbowave; MLS GmbH) za použití směsi HNO3 a zinku izolovaného z matrice iontovou výměnou chromatografií. Vyšetřovatelé použijí pro přípravu vzorků ultračisté kyseliny.

Stanovení absorpce zinku Krev a izotopové složení zinku bude analyzováno duplicitně v ETH Human Nutrition Laboratory. Vzorky moči budou mineralizovány mikrovlnnou digescí (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) za použití směsi HNO3 a H2O2 a zinku izolovaného z matrice vzorku pomocí iontoměničové chromatografie (Wegmuller et al 2014). Všechny kyseliny použité pro přípravu vzorků budou ultračisté. Izotopové poměry 70Zn:66Zn a 67Zn:66Zn budou měřeny za účelem stanovení obohacení 70Zn a 67Zn ve vzorcích moči za použití vysokorozlišovacího multikolektoru s indukčně vázaným plazmovým hmotnostním spektrometrem s dvojitým ohniskovým magnetickým sektorem (Finnigan Neptune; Thermo Electron). 12 Frakční absorpce dávky 67Zn z testovaných jídel se vypočte za použití orální až i.v. metoda poměru indikátorů aplikovaná na vzorky moči podle principů popsaných Frielem et al.

7denní záznam jídla Pomocí metody evidence všech potravin snědených během 7denního období mohou vyšetřovatelé získat informace o všech potravinách snědených za týden (včetně soboty a neděle). Aby toho dosáhli, vyšetřovatelé požádají subjekty, aby si zapsaly všechna zkonzumovaná jídla, podrobnosti o přípravě jídla a všechny nápoje (včetně vody), které účastníci snědli nebo vypili. Účastníci by si měli poznamenat jídlo, při kterém bylo jídlo a pití zkonzumováno, a čas strávený na konzumaci (snídaně, oběd, večeře a mezi jídly (svačina) a množství snědené v každou denní dobu). Za tímto účelem vyšetřovatelé dají subjektům tablet, ve kterém zaznamenávají spotřebu/jídla a také pořizují fotografii veškerého snědeného jídla.

SPECIFICKÉ METODY PRO HODNOCENÍ DOPADU Údaje o dietním příjmu, sérovém feritinu a biologické dostupnosti železa budou použity pro dva modelovací přístupy. Za prvé, výzkumníci použijí metodu Disability Adjusted Life Year (DALY), což je vhodná metoda pro odhad nutričních a zdravotních dopadů biofortifikovaných plodin. To bude vycházet z modelů, které byly vyvinuty společně CIP a IIN, které stanovily předpoklady týkající se biologické dostupnosti železa a zinku z brambor. Za druhé, výzkumníci použijí údaje o obvyklém příjmu železa, sérových koncentracích feritinu a vypočtených fyziologických požadavcích na železo k přizpůsobení modelového odhadu biologické dostupnosti železa v potravě v Evropě, oblasti Andské vysočiny a obecněji v zemích s nízkými a středními příjmy.