IJzer en zink biologische beschikbaarheid van bioversterkte aardappelen

Type studie en populatie Dubbelblinde gerandomiseerde studie van natuurlijk bioverrijkte aardappelen, uit te voeren in Huancavelica, Perú. Er zullen ongeveer 100 vrouwen en 80 mannen tussen 18 en 45 jaar worden aangeworven die in de stad Huancavelica wonen.

ETHIEK Aanvragen zijn ingediend en goedgekeurd door de Research Ethics Committee (REC) van de University of East Anglia Faculty of Medicine and Health (FMH) in Norwich (VK) en een REC van het Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) in Peru.

Elke deelnemer wordt volledig op de hoogte gehouden van alle procedures en krijgt de gelegenheid om vragen te stellen en alle verdere details te ontvangen die deelnemers nodig hebben.

De procedures (bloedmonsters, urinemonsters, antropometrie, terugroepen van het dieet) worden uitgelegd aan de personen die ermee instemmen deel te nemen aan de eerste screening, en de deelnemers worden uitgenodigd om het eerste toestemmingsformulier te ondertekenen.

SPECIFIEKE METHODEN VOOR IJZERONDERZOEK (Fase 1) Steekproefomvang Voor het onderzoek is een inschrijving van in totaal 30 vrouwen vereist, zodat 33% die zich niet aan het protocol houdt, een uiteindelijke steekproefomvang van 20 vrouwen kan bereiken. De onderzoekers schatten dat de onderzoekers ongeveer 100 vrouwen moeten screenen.

Voedingsstatus Als onderdeel van de screening worden alle potentiële kandidaten gewogen en gemeten met behulp van gestandaardiseerde apparatuur.

Meting van fysieke activiteit Alle deelnemers wordt gevraagd een actigraaf (een drieassige versnellingsmeter) te gebruiken die fysieke activiteit (beweging) in drie dimensies meet.

Bloedmonster Een goed opgeleid lid van het onderzoeksteam neemt een veneus bloedmonster af (ongeveer 6 ml in een reageerbuis met heparine) om ferritine, hemoglobine en CRP te meten (screening en nog 3 keer: baseline, 16 en 40 dagen na de eerste dag). van aardappelopname).

Urinemonster Deelnemers wordt gevraagd een urinemonster (30ml) af te staan ​​om een ​​zwangerschapstest uit te voeren met behulp van een teststrip.

Sociodemografische en voedselzekerheidsenquête De onderzoekers zullen een sociaaleconomische enquête en de ELCSA-vragenlijst over voedselzekerheid opnemen, die beide zullen worden toegepast op alle ingeschreven deelnemers.

Studieprocedures Volgens de resultaten van de screening en herziening van de criteria voor in- en uitsluiting en na informatie en verificatie dat deelnemers het toestemmingsformulier voor ijzeronderzoek begrijpen, zullen proefpersonen worden uitgenodigd om deel te nemen. Toegestane deelnemers worden willekeurig toegewezen om een ​​van de twee soorten aardappelen te consumeren (biofortified-A of niet-B). Het eerste aardappelras wordt gegeven gedurende de eerste 2 weken (dag 1-12) en de tweede reeks tussen dag 15-26 (in beide gevallen uitgezonderd weekenddagen zaterdag en zondag). De aardappelen worden gekookt in water en gepureerd aangeboden.

Er zullen 5 keer bloedmonsters worden genomen: 1) bij de screening om na te gaan of aan de uitsluitings- en inclusiecriteria wordt voldaan; dan op dag 1 voordat deelnemers de eerste aardappelsoort eten, dag 15 voordat ze de tweede aardappelsoort eten, dag 26 nadat ze alle beide aardappelsoorten hebben gegeten en op dag 40 twee weken nadat ze alle aardappelen hebben gegeten.

Consumptie van de aardappel Elke deelnemer krijgt 500 g aardappel voorgeschoteld, verdeeld over twee porties van elk 250 g. elke deelnemer neemt, afhankelijk van hun toewijzing, 0,3 mg 57FeSO4 (Peruanita-aardappel) of 0,3 mg 58FeSO4 (bioversterkte aardappel), verdund in 50 ml gedestilleerd water, dat moet worden gedronken terwijl de deelnemers de aardappel eten - halverwege de maaltijd. Daarnaast krijgt elke deelnemer 200 ml gedestilleerd water om te drinken. De isotopen zullen worden geleverd door ETH (Zwitsers Federaal Instituut voor Technologie in Zürich). Bovendien zijn de isotopen die de onderzoekers zullen gebruiken stabiele isotopen, dat wil zeggen dat deelnemers van nature in de omgeving voorkomen en als zodanig geen enkel risico vormen.

Verzameling van biologische monsters voor de meting van ijzer met behulp van stabiele isotopen Bloedmonsters zullen tijdens de interventieperiode worden verzameld zoals eerder beschreven en zullen worden verzonden naar ETH, Zürich, volgens de standaardprocedures. Deelnemers worden geïnformeerd en geven toestemming voor de overdracht en het gebruik van hun monsters buiten Peru' ten behoeve van dit onderzoek. Monsters worden geanonimiseerd en worden niet vervoerd met persoonlijk identificeerbare gegevens.

Wat de verwerking betreft, worden monsters gemengd met NO3 en H2O2 en ontsloten in een magnetron, gevolgd door scheiding van het ijzer van de bloedmatrix door middel van uitwisseling-anionchromatografie en een oplosmiddel (verdunningsmiddel) of extractie uit het oplosmiddel met gedestilleerd.

De isotopen zullen worden geanalyseerd met behulp van een plasma-gekoppelde inductieve multicollector massaspectrometer (Neptune; Thermo Finnigan). De hoeveelheid van de gelabelde ijzerisotopen 57Fe en 58Fe wordt 14 dagen na consumptie van beide aardappelsoorten gemeten. De berekening (van absorptie) zal worden gedaan rekening houdend met het geschatte bloedvolume van de proefpersoon op basis van gewicht, lengte en de gemeten hemoglobineconcentratie van de proefpersoon (rekening houdend met het gemiddelde van het eerste en laatste bloedmonster). De berekening is gebaseerd op het principe van isotopenverdunning, rekening houdend met de factor voor de ijzerisotoopmarker in plaats van de monoisotopische marker8. Voor de berekening van de geabsorbeerde fractie gaan de onderzoekers uit van 80% opname van het geabsorbeerde ijzer.

SPECIFIEKE METHODEN VOOR ZINKONDERZOEK (Fase 2) Steekproefomvang Voor het onderzoek is een steekproefomvang van 40 vrouwen vereist. Dit zorgt voor een verlies van 40% om een ​​uiteindelijk totaal van 24 vrouwen te bereiken.

Procedures Volgens de resultaten van de screening, en na controle dat deelnemers voldoen aan alle inclusiecriteria en geen van de exclusiecriteria, zullen deelnemers worden uitgenodigd om deel te nemen aan het zinkgedeelte van het onderzoek. Hiervoor krijgt de deelnemer het tweede toestemmingsformulier om te lezen en degenen die het formulier accepteren en ondertekenen, worden uitgenodigd om deel te nemen aan het onderzoek.

De mensen die accepteren, worden willekeurig toegewezen om de ene of de andere aardappelsoort te eten (biofortified-A of no-B). Alle deelnemers krijgen beide soorten aardappelen maar in een andere volgorde, op deze manier heeft elke deelnemer zijn eigen controle. De eerste aardappelsoort wordt gegeven op dag 1, na acceptatie van deelname aan het onderzoek, en na acceptatie en ondertekening van het toestemmingsformulier voor dit onderdeel: (consumptieprotocol en tweede variëteit wordt gegeten 29 dagen daarna (bestelling aardappelrassen wordt willekeurig toegewezen).

De onderzoekers nemen bij drie gelegenheden bloedmonsters: inschrijving en dag 1 en 29 (de dagen waarop deelnemers de aardappel eten) na 8 uur vasten (voedsel) en 6 uur (vloeistoffen).

Studiemetingen Antropometrie Als onderdeel van de screening worden alle potentiële kandidaten gewogen en gemeten met behulp van gestandaardiseerde apparatuur. Op basis van hun gewicht en BMI zullen de onderzoekers beslissen of deelnemers in aanmerking komen.

Toegestane deelnemers zullen worden gevraagd om een ​​veneus bloedmonster te verstrekken (ongeveer 10 ml in een reageerbuis met heparine). Uit de bloedmonsters worden plasma en verpakte rode bloedcellen gehaald en bij <18oC bewaard.

Urinemonster Toegestane deelnemers zullen een urinemonster (30 ml) verstrekken als onderdeel van de screeningsfase om een ​​zwangerschapstest uit te voeren. Op dag 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 en 36 verzamelen de onderzoekers urinemonsters om het zinkgehalte te analyseren. De onderzoekers hebben elke dag 100 ml urine nodig, verzameld in de ochtend (tussen 7-12 uur 's ochtends).

Consumptie van de aardappel De proefpersonen krijgen in totaal 1000 gram aardappel in twee porties van 500 gram. De eerste portie wordt gegeven terwijl de deelnemers nuchter zijn (minstens 8 uur voor eten en 6 uur voor drinken) en in twee afzonderlijke porties (elk 250 g). Wanneer deelnemers de eerste portie van 250 g hebben gegeten, krijgt de proefpersoon 0,25 mg 67Zn verdund in 50 ml flessenwater en vervolgens krijgen de deelnemers de tweede portie aardappel. Twee uur later krijgen de deelnemers een intraveneus infuus van 70Zn (200 ug) verdund in 50 ml flessenwater. Na nog eens 2 uur krijgen de deelnemers de tweede twee porties aardappel en, net als voorheen, krijgen de deelnemers na de eerste portie 0,25 mg 67Zn verdund in 50 ml flessenwater. Gedurende deze periode en gedurende 3 uur na de tweede portie aardappel zal de proefpersoon geen voedsel of vloeistof consumeren, behalve water dat de deelnemers zullen krijgen. Elke proefpersoon krijgt 200 ml water bij elke maaltijd en 200 ml water tussen de maaltijden door. Momenteel is het gebruik van isotopen de beste methode om de opname van zink te meten. Bovendien zijn de gebruikte isotopen stabiele isotopen, dat wil zeggen dat deelnemers van nature in de omgeving voorkomen en geen risico vormen. Na het eten van de laatste portie aardappel mag er minimaal 3 uur niet gegeten of gedronken worden.

Bloedmonsters voor meting van zink De onderzoekers nemen in totaal drie bloedmonsters af. Absorptie met behulp van stabiele isotopen (dag 29) De verzamelde bloedmonsters worden verzonden naar ETH, Zürich. ETH zal de analyse van CRP voor zink uitvoeren. De CRP wordt gemeten met behulp van een ELISA-kit. De zinkconcentratie in het plasma zal worden gemeten door middel van inductie plasma-gekoppelde massaspectrometrie.

Urinemonsters voor meting van zink met behulp van stabiele isotopen Monsters van urine worden geconcentreerd met behulp van vriesdrogen en vervolgens gemineraliseerd door digestie in een magnetron (MLS-Turbowave; MLS GmbH) met behulp van een mengsel van HNO3 en zink geïsoleerd uit de hoofdmatrix door ionenuitwisseling chromatografie. De onderzoekers zullen ultrazuivere zuren gebruiken voor de voorbereiding van de monsters.

Bepaling van zinkabsorptie Bloed en zinkisotopensamenstelling zullen in tweevoud worden geanalyseerd in het ETH Humane Voedingslaboratorium. Urinemonsters zullen worden gemineraliseerd door microgolfontsluiting (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) met behulp van een mengsel van HNO3 en H2O2 en zink geïsoleerd uit de monstermatrix door middel van ionenuitwisselingschromatografie (Wegmuller et al 2014). Alle zuren die worden gebruikt voor de voorbereiding van monsters zullen ultrapuur zijn. 70Zn:66Zn en 67Zn:66Zn isotopenverhoudingen zullen worden gemeten om de 70Zn en 67Zn verrijking in de urinemonsters te bepalen door gebruik te maken van een hoge resolutie dubbel-focusserende magnetische sectorveld multi-collector inductief gekoppelde plasma massaspectrometer (Finnigan Neptune; Thermo Electron). 12 De fractionele absorptie van de dosis 67Zn uit de testmaaltijden wordt berekend door de orale tot i.v. tracers ratio-methode toegepast om urinemonsters te spotten, volgens principes beschreven door Friel et al.

7-daagse voedselregistratie Met behulp van de methode van het registreren van alle voedingsmiddelen die gedurende een periode van 7 dagen zijn gegeten, kunnen de onderzoekers informatie verkrijgen over alle voedingsmiddelen die in een week zijn gegeten (inclusief zaterdag en zondag). Om dit te bereiken, zullen de onderzoekers de proefpersonen vragen om een ​​verslag te maken van al het geconsumeerde voedsel, de details van de voedselbereiding en alle drankjes (inclusief water) die de deelnemers hebben gegeten of gedronken. Deelnemers moeten noteren bij welke maaltijd het eten en drinken werd genuttigd, de tijd die nodig was om het te eten (ontbijt, lunch, avondmaal en tussendoortjes (snacks) en de hoeveelheid die op elk moment van de dag werd gegeten. Hiervoor geven de onderzoekers de proefpersonen een tablet om de consumptie/maaltijden te registreren en maken ze ook een foto van al het gegeten voedsel.

METHODEN SPECIFIEK VOOR EFFECTBEOORDELING De gegevens over inname via de voeding, serumferritine en biologische beschikbaarheid van ijzer zullen worden gebruikt voor twee modelleringsbenaderingen. Ten eerste zullen de onderzoekers de Disability Adjusted Life Year (DALY)-methode toepassen, wat een geschikte methode is om de voedings- en gezondheidseffecten van bioverrijkte gewassen te schatten. Dit zal voortbouwen op modellen die gezamenlijk zijn ontwikkeld door CIP en IIN die aannames hebben gedaan met betrekking tot de biologische beschikbaarheid van ijzer en zink uit aardappelen. Ten tweede zullen de onderzoekers gegevens over de gebruikelijke ijzerinname, serum-ferritineconcentraties en berekende fysiologische vereisten voor ijzer gebruiken om een ​​modelschatting van de biologische beschikbaarheid van ijzer in Europa, de Andes-hooglanden en, meer in het algemeen, in lage- en middeninkomenslanden aan te passen.