Bioverfügbarkeit von Eisen und Zink aus bioangereicherten Kartoffeln

Art der Studie und Population Doppelblinde, randomisierte Studie mit natürlich bioangereicherten Kartoffeln, die in Huancavelica, Peru, durchgeführt werden soll. Es werden etwa 100 Frauen und 80 Männer im Alter von 18 bis 45 Jahren rekrutiert, die in der Stadt Huancavelica leben.

ETHIK-Anträge wurden vom Research Ethics Committee (REC) der University of East Anglia Faculty of Medicine and Health (FMH) in Norwich (UK) und einem REC des Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) in Peru eingereicht und genehmigt.

Jeder Teilnehmer wird vollständig über alle Verfahren informiert und erhält die Möglichkeit, Fragen zu stellen und alle weiteren Details zu erhalten, die die Teilnehmer benötigen.

Die Verfahren (Blutproben, Urinproben, Anthropometrie, Ernährungserinnerung) werden den Personen erklärt, die sich bereit erklären, am ersten Screening teilzunehmen, und die Teilnehmer werden aufgefordert, die erste Einverständniserklärung zu unterschreiben.

SPEZIFISCHE METHODEN FÜR DIE EISENSTUDIE (Phase 1) Stichprobengröße Die Studie erfordert eine Aufnahme von insgesamt 30 Frauen, damit 33 %, die sich nicht an das Protokoll halten, eine endgültige Stichprobengröße von 20 Frauen erreichen. Die Ermittler schätzen, dass die Ermittler etwa 100 Frauen untersuchen müssen.

Ernährungsstatus Als Teil des Screenings werden alle potenziellen Kandidaten mit standardisierten Geräten gewogen und gemessen.

Messung der körperlichen Aktivität Alle Teilnehmer werden gebeten, einen Aktigraphen (ein dreiachsiger Beschleunigungsmesser) zu verwenden, der die körperliche Aktivität (Bewegung) in drei Dimensionen misst.

Blutprobe Ein entsprechend geschultes Mitglied des Studienteams entnimmt eine venöse Blutprobe (ca. 6 ml in einem Reagenzglas mit Heparin), um Ferritin, Hämoglobin und CRP zu messen (Screening und 3 weitere Male: Ausgangswert, 16 und 40 Tage nach dem ersten Tag des Kartoffelkonsums).

Urinprobe Die Teilnehmerinnen werden gebeten, eine Urinprobe (30 ml) abzugeben, um einen Schwangerschaftstest mit einem Teststreifen durchzuführen.

Soziodemografische und Ernährungssicherheitsumfrage Die Ermittler werden eine sozioökonomische Umfrage und den ELCSA-Fragebogen zur Ernährungssicherheit einschließen, die beide bei allen eingeschriebenen Teilnehmern angewendet werden.

Studienverfahren Gemäß den Ergebnissen des Screenings und der Überarbeitung der Kriterien für Einschluss und Ausschluss und der folgenden Informationen und Überprüfung, dass die Teilnehmer die Einverständniserklärung für die Eisenstudie verstehen, werden die Probanden zur Teilnahme eingeladen. Eingewilligte Teilnehmer werden nach dem Zufallsprinzip dem Verzehr der einen oder anderen der beiden Kartoffelsorten (biofortifiziert-A oder nicht-B) zugeteilt. Die erste Kartoffelsorte wird während der ersten 2 Wochen (Tag 1-12) und die zweite Folge zwischen den Tagen 15-26 (in beiden Fällen ausgenommen die Wochenendtage Samstag und Sonntag) gegeben. Die Kartoffeln werden in Wasser gekocht und püriert angeboten.

Blutproben werden fünfmal entnommen, 1) beim Screening, um die Einhaltung der Ausschluss- und Einschlusskriterien zu überprüfen; dann am Tag 1 vor dem Verzehr der ersten Kartoffelsorte, am 15. Tag vor dem Verzehr der zweiten Kartoffelsorte, am 26. Tag nach dem Verzehr aller beiden Kartoffelsorten und am 40. Tag zwei Wochen nach dem Verzehr der gesamten Kartoffel.

Verzehr der Kartoffel Jedem Teilnehmer werden 500 g Kartoffel, aufgeteilt in zwei Portionen zu je 250 g, serviert. Jeder Teilnehmer nimmt je nach Zuteilung 0,3 mg 57FeSO4 (Peruanita-Kartoffel) oder 0,3 mg 58FeSO4 (biofortifizierte Kartoffel), verdünnt in 50 ml destilliertem Wasser, das getrunken werden sollte, während die Teilnehmer die Kartoffel essen - nach der Hälfte der Mahlzeit. Zusätzlich erhält jeder Teilnehmer 200 ml destilliertes Wasser zu trinken. Die Isotope werden von der ETH (Eidgenössische Technische Hochschule Zürich) bereitgestellt. Darüber hinaus sind die Isotope, die die Ermittler verwenden werden, stabile Isotope, d. h. die Teilnehmer kommen natürlicherweise in der Umwelt vor und stellen als solche kein Risiko dar.

Entnahme biologischer Proben für die Messung von Eisen mit stabilen Isotopen Blutproben werden während der gesamten Interventionsdauer wie zuvor beschrieben entnommen und gemäß Standardverfahren an die ETH, Zürich, gesendet. Die Teilnehmer werden informiert und stimmen dem Transfer und der Verwendung ihrer Proben außerhalb Perus für die Zwecke dieser Forschungsstudie zu. Die Proben werden anonymisiert und nicht mit personenbezogenen Daten transportiert.

Bei der Aufarbeitung werden die Proben mit NO3 und H2O2 gemischt und in der Mikrowelle aufgeschlossen, gefolgt von der Abtrennung des Eisens von der Blutmatrix mittels Austausch-Anionen-Chromatographie und einem Lösungsmittel (Verdünnungsmittel) oder Extraktion aus dem Lösungsmittel mit Destillat.

Die Isotope werden mit einem plasmagekoppelten induktiven Multikollektor-Massenspektrometer (Neptune; Thermo Finnigan) analysiert. Die Menge der markierten Eisenisotope 57Fe und 58Fe wird 14 Tage nach dem Verzehr beider Kartoffelsorten gemessen. Die Berechnung (der Absorption) erfolgt unter Berücksichtigung des geschätzten Blutvolumens des Probanden basierend auf Gewicht, Größe und der gemessenen Hämoglobinkonzentration des Probanden (unter Berücksichtigung des Durchschnitts der anfänglichen und letzten Blutprobe). Die Berechnung basiert auf dem Prinzip der Isotopenverdünnung, wobei als Faktor eher der Eisenisotopenmarker als der Monoisotopenmarker8 berücksichtigt wird. Für die Berechnung des resorbierten Anteils gehen die Untersucher von 80 % Einbau des resorbierten Eisens aus.

SPEZIFISCHE METHODEN FÜR DIE ZINKSTUDIE (Phase 2) Stichprobengröße Die Studie erfordert eine Stichprobengröße von 40 Frauen. Dies ermöglicht einen Verlust von 40 %, um eine Gesamtzahl von 24 Frauen zu erreichen.

Verfahren Gemäß den Screening-Ergebnissen und nachdem überprüft wurde, ob die Teilnehmer alle Einschlusskriterien und keines der Ausschlusskriterien erfüllen, werden die Teilnehmer zur Teilnahme am Zink-Teil der Studie eingeladen. Für diesen Teilnehmer wird die zweite Einwilligungserklärung zum Lesen ausgehändigt, und diejenigen, die das Formular akzeptieren und unterschreiben, werden zur Teilnahme an der Studie eingeladen.

Die Personen, die akzeptieren, werden nach dem Zufallsprinzip der einen oder anderen Kartoffelsorte (biofortified-A oder no-B) zugeteilt. Alle Teilnehmer erhalten beide Kartoffelsorten, aber in unterschiedlicher Reihenfolge, auf diese Weise ist jeder Teilnehmer seine eigene Kontrolle. Die erste Kartoffelsorte wird am Tag 1 nach Annahme der Teilnahme an der Studie und nach Annahme und Unterzeichnung der Einwilligungserklärung für diesen Teil verabreicht: (Verzehrprotokoll und zweite Sorte wird 29 Tage danach gegessen (Reihenfolge der Kartoffelsorten wird zufällig vergeben).

Die Ermittler nehmen bei drei Gelegenheiten Blutproben: bei der Einschreibung und an den Tagen 1 und 29 (die Tage, an denen die Teilnehmer die Kartoffel essen) nach 8 Stunden (Nahrung) und 6 Stunden (Flüssigkeiten) Fasten.

Studienmessungen Anthropometrie Als Teil des Screenings werden alle potenziellen Kandidaten mit standardisierten Geräten gewogen und gemessen. Je nach Gewicht und BMI entscheiden die Ermittler, ob die Teilnehmer teilnahmeberechtigt sind.

Eingewilligte Teilnehmer werden gebeten, eine venöse Blutprobe abzugeben (ca. 10 ml in einem Reagenzglas mit Heparin). Aus den Blutproben werden Plasma und Erythrozytenkonzentrate gewonnen und bei <18 °C gelagert.

Urinprobe Eingewilligte Teilnehmerinnen stellen im Rahmen der Screening-Phase zur Durchführung eines Schwangerschaftstests eine Urinprobe (30 ml) zur Verfügung. An den Tagen 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 und 36 werden die Ermittler Urinproben sammeln, um den Zinkgehalt zu analysieren. An jedem Tag benötigen die Untersucher 100 ml Urin, gesammelt am Morgen (zwischen 7-12 Uhr morgens).

Verzehr der Kartoffel Den Probanden werden insgesamt 1000 g Kartoffel in zwei 500-g-Portionen verabreicht. Die erste Portion wird verabreicht, während die Teilnehmer nüchtern sind (mindestens 8 Stunden zum Essen und 6 Stunden zum Trinken) und in zwei getrennten Portionen (je 250 g). Wenn die Teilnehmer die erste 250-g-Portion gegessen haben, erhält der Proband 0,25 mg 67Zn, verdünnt in 50 ml Mineralwasser, und dann erhalten die Teilnehmer die zweite Portion Kartoffel. Zwei Stunden später erhalten die Teilnehmer eine intravenöse Infusion von 70Zn (200 ug), verdünnt in 50 ml Mineralwasser. Nach weiteren 2 Stunden erhalten die Teilnehmer die zweiten beiden Portionen Kartoffeln, und wie zuvor erhalten die Teilnehmer nach der ersten Portion 0,25 mg 67Zn verdünnt in 50 ml Mineralwasser. Während dieser Zeit und für 3 Stunden nach der zweiten Portion Kartoffel nimmt die Testperson keine Nahrung oder Flüssigkeit zu sich, außer Wasser, das den Teilnehmern zur Verfügung gestellt wird. Jeder Proband erhält 200 ml Wasser zu jeder Mahlzeit und 200 ml Wasser zwischen den Mahlzeiten. Derzeit ist die Verwendung von Isotopen die beste Methode zur Messung der Absorption von Zink. Darüber hinaus handelt es sich bei den verwendeten Isotopen um stabile Isotope, d. h. die Teilnehmer kommen natürlicherweise in der Umwelt vor und stellen kein Risiko dar. Nach dem Verzehr der letzten Portion Kartoffel dürfen mindestens 3 Stunden lang keine Speisen oder Getränke verzehrt werden.

Blutproben zur Zinkmessung Die Untersucher werden insgesamt drei Blutproben entnehmen. Absorption mit stabilen Isotopen (Tag 29) Die gesammelten Blutproben werden an die ETH Zürich geschickt. Die ETH wird die Analyse von CRP für Zink durchführen. Das CRP wird mit einem ELISA-Kit gemessen. Die Plasma-Zink-Konzentration wird durch Induktions-Plasma-gekoppelte Massenspektrometrie gemessen.

Urinproben zur Messung von Zink mit stabilen Isotopen Urinproben werden durch Gefriertrocknung konzentriert und anschließend durch Aufschluss in einem Mikrowellenofen (MLS-Turbowave; MLS GmbH) mit einer Mischung aus HNO3 und Zink, die durch Ionenaustausch aus der Mastermatrix isoliert wurde, mineralisiert Chromatographie. Für die Probenvorbereitung verwenden die Forscher hochreine Säuren.

Bestimmung der Zinkresorption Blut und Zinkisotopenzusammensetzung werden im Labor für Humanernährung der ETH doppelt analysiert. Urinproben werden durch Mikrowellenaufschluss (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) unter Verwendung einer Mischung aus HNO3 und H2O2 und Zink, das durch Ionenaustauschchromatographie aus der Probenmatrix isoliert wurde, mineralisiert (Wegmüller et al 2014). Alle für die Probenvorbereitung verwendeten Säuren sind hochrein. Die 70Zn:66Zn- und 67Zn:66Zn-Isotopenverhältnisse werden gemessen, um die 70Zn- und 67Zn-Anreicherung in den Urinproben zu bestimmen, indem ein hochauflösendes doppelt fokussierendes Magnetsektorfeld-Multikollektor-Massenspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (Finnigan Neptune; Thermo Electron) verwendet wird. 12 Die fraktionierte Absorption der 67Zn-Dosis aus den Testmahlzeiten wird unter Verwendung der oralen bis i.v. Tracer-Quotient-Methode, angewandt auf Spot-Urinproben, gemäß den von Friel et al.

7-Tage-Ernährungsaufzeichnung Mit der Methode der Registrierung aller über einen Zeitraum von 7 Tagen verzehrten Lebensmittel können die Untersucher Informationen über alle in einer Woche (einschließlich Samstag und Sonntag) verzehrten Lebensmittel erhalten. Um dies zu erreichen, bitten die Ermittler die Probanden, Aufzeichnungen über alle verzehrten Lebensmittel, Details der Essenszubereitung und alle Getränke (einschließlich Wasser) zu machen, die die Teilnehmer gegessen oder getrunken haben. Die Teilnehmer sollten die Mahlzeit notieren, bei der die Speisen und Getränke verzehrt wurden, und die dafür benötigte Zeit (Frühstück, Mittagessen, Abendessen und Zwischenmahlzeiten (Snacks) sowie die zu jeder Tageszeit verzehrten Mengen. Dazu geben die Ermittler den Probanden ein Tablet, auf dem sie den Verzehr/die Mahlzeiten registrieren und außerdem ein Foto aller verzehrten Lebensmittel machen.

SPEZIFISCHE METHODEN FÜR DIE FOLGENABSCHÄTZUNG Die Daten zur Nahrungsaufnahme, zum Serumferritin und zur Bioverfügbarkeit von Eisen werden für zwei Modellierungsansätze verwendet. Erstens werden die Forscher die Methode des behindertengerechten Lebensjahres (DALY) anwenden, die eine geeignete Methode ist, um die ernährungsphysiologischen und gesundheitlichen Auswirkungen von biofortifizierten Pflanzen abzuschätzen. Dies wird auf Modellen aufbauen, die gemeinsam von CIP und IIN entwickelt wurden und Annahmen zur Bioverfügbarkeit von Eisen und Zink aus Kartoffeln getroffen haben. Zweitens werden die Forscher Daten über die gewohnheitsmäßige Eisenaufnahme, Serum-Ferritin-Konzentrationen und den berechneten physiologischen Bedarf an Eisen verwenden, um eine Modellschätzung der Bioverfügbarkeit von Eisen aus der Nahrung in Europa, der Andenhochlandregion und ganz allgemein in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen anzupassen.