Biodisponibilidade de ferro e zinco de batatas biofortificadas

Tipo de estudo e população Ensaio randomizado duplo-cego de batatas naturalmente biofortificadas a ser realizado em Huancavelica, Peru. Serão recrutados cerca de 100 mulheres e 80 homens de 18 a 45 anos residentes na cidade de Huancavelica.

As inscrições de ÉTICA foram submetidas e aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa (REC) da Faculdade de Medicina e Saúde (FMH) da Universidade de East Anglia em Norwich (Reino Unido) e um REC do Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) no Peru.

Cada participante será totalmente informado sobre todos os procedimentos e terá a oportunidade de fazer perguntas e receber quaisquer detalhes que os participantes desejarem.

Os procedimentos (amostras de sangue, amostras de urina, antropometria, recordatório alimentar) serão explicados aos indivíduos que concordarem em participar da triagem inicial, e os participantes serão convidados a assinar o primeiro termo de consentimento.

MÉTODOS ESPECÍFICOS PARA ESTUDO DE FERRO (Fase 1) Tamanho da amostra O estudo requer a inscrição de um total de 30 mulheres para permitir que 33% que não aderem ao protocolo atinjam um tamanho de amostra final de 20 mulheres. Os investigadores estimam que podem precisar rastrear cerca de 100 mulheres.

Estado Nutricional Como parte da triagem, todos os potenciais candidatos serão pesados ​​e medidos usando equipamentos padronizados.

Medição da atividade física Todos os participantes serão convidados a usar um actigraph (um acelerômetro triaxial) que mede a atividade física (movimento) em três dimensões.

Amostra de sangue Um membro devidamente treinado da equipe do estudo coletará uma amostra de sangue venoso (aproximadamente 6ml em um tubo de ensaio com heparina) para medir ferritina, hemoglobina e PCR (triagem e mais 3 vezes: linha de base, 16 e 40 dias após o primeiro dia da ingestão de batata).

Amostra de urina Os participantes serão solicitados a fornecer uma amostra de urina (30ml) para realizar um teste de gravidez usando uma tira de teste.

Inquérito sociodemográfico e de segurança alimentar Os investigadores incluirão um inquérito socioeconómico e o questionário de segurança alimentar ELCSA será aplicado a todos os participantes inscritos.

Procedimentos do estudo De acordo com os resultados da triagem e revisão dos critérios de inclusão e exclusão e após a informação e verificação de que os participantes compreenderam o formulário de consentimento do estudo de ferro, os indivíduos serão convidados a participar. Os participantes consentidos serão designados aleatoriamente para consumir um ou outro dos dois tipos de batata (biofortificada-A ou não-B). A primeira variedade de batata será fornecida durante as primeiras 2 semanas (dia 1-12) e a segunda sequência entre os dias 15-26 (em ambos os casos, excluindo os dias de fim de semana, sábado e domingo). As batatas serão cozidas em água e oferecidas amassadas.

Amostras de sangue serão coletadas em 5 ocasiões, 1) na triagem para verificar o cumprimento dos critérios de exclusão e inclusão; depois, no dia 1 antes dos participantes comerem o primeiro tipo de batata, no dia 15 antes de comer o segundo tipo de batata, no dia 26 depois de comer todos os dois tipos de batata e no dia 40, duas semanas depois de comer toda a batata.

Consumo da Batata Para cada participante serão servidos 500 g de batata divididos em duas porções de 250 g cada. cada participante tomará, conforme sua alocação, 0,3 mg de 57FeSO4 (batata Peruanita) ou 0,3 mg de 58FeSO4 (batata biofortificada), diluído em 50 ml de água destilada, que deverá ser ingerido enquanto os participantes comem a batata - na metade do refeição. Além disso, cada participante receberá 200 ml de água destilada para beber. Os isótopos serão fornecidos pelo ETH (Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Zurique). Além disso, os isótopos que os investigadores usarão são isótopos estáveis, ou seja, os participantes existem naturalmente no ambiente e, como tal, não representam nenhum risco.

Coleta de amostras biológicas para dosagem de ferro por isótopos estáveis ​​As amostras de sangue serão coletadas durante todo o período de intervenção conforme descrito anteriormente e serão enviadas para ETH, Zurique, seguindo procedimentos operacionais padrão. Os participantes serão informados e darão consentimento para a transferência e uso de suas amostras fora do Peru para o propósito deste estudo de pesquisa. As amostras serão anonimizadas e não serão transportadas com dados pessoais identificáveis.

Em termos de processamento, as amostras serão misturadas com NO3 e H2O2 e digeridas em micro-ondas, seguida da separação do ferro da matriz sanguínea por meio de cromatografia de ânion de troca e um solvente (diluente) ou extração do solvente usando destilado.

Os isótopos serão analisados ​​usando um espectrômetro de massa multicoletor indutivo acoplado a plasma (Neptune; Thermo Finnigan). A quantidade dos isótopos de ferro marcados 57Fe e 58Fe será medida 14 dias após o consumo de ambos os tipos de batata. O cálculo (de absorção) será feito considerando o volume de sangue estimado do sujeito com base no peso, altura e concentração de hemoglobina medida do sujeito (considerando a média da amostra de sangue inicial e final). O cálculo é baseado no princípio da diluição isotópica considerando como fator o marcador isotópico de ferro ao invés do marcador monoisotópico8. Para o cálculo da fração absorvida os investigadores assumirão 80% de incorporação do ferro absorvido.

MÉTODOS ESPECÍFICOS PARA ESTUDO DE ZINCO (Fase 2) Tamanho da amostra O estudo requer um tamanho de amostra de 40 mulheres. Isso permite uma perda de 40% para atingir um total final de 24 mulheres.

Procedimentos De acordo com os resultados da triagem, e após a verificação de que os participantes cumprem todos os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão, os participantes serão convidados a participar da parte de zinco do estudo. Para este participante será entregue o segundo termo de consentimento para leitura e aqueles que aceitarem e assinarem o formulário serão convidados a participar do estudo.

As pessoas que aceitarem serão alocadas aleatoriamente para comer um ou outro tipo de batata (biofortificada-A ou não-B). Todos os participantes receberão os dois tipos de batata, mas em ordem diferente, desta forma cada participante será seu próprio controle. A primeira variedade de batata será dada no dia 1, após aceitar participar do estudo, e após aceitar e assinar o termo de consentimento para esta parte: (protocolo de consumo e segunda variedade serão ingeridos 29 dias depois (a ordem das variedades de batata serão atribuídos aleatoriamente).

Os investigadores colherão amostras de sangue em três ocasiões: inscrição e dias 1 e 29 (dias em que os participantes comem a batata) após jejum de 8 horas (comida) e 6 horas (líquidos).

Medições do estudo Antropometria Como parte da triagem, todos os candidatos em potencial serão pesados ​​e medidos usando equipamentos padronizados. De acordo com seu peso e IMC, os investigadores decidirão se os participantes são elegíveis.

Os participantes consentidos serão solicitados a fornecer uma amostra de sangue venoso (aproximadamente 10ml em um tubo de ensaio com heparina). O plasma e os concentrados de hemácias serão obtidos das amostras de sangue e armazenados a <18oC.

Amostra de urina Os participantes consentidos fornecerão uma amostra de urina (30ml) como parte da fase de triagem para realizar um teste de gravidez. Nos dias 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 e 36, os investigadores coletarão amostras de urina para analisar o teor de zinco. A cada dia os investigadores precisam de 100ml de urina, coletada pela manhã (entre 7-12 horas da manhã).

Consumo da batata Os sujeitos receberão um total de 1000 g de batata em duas porções de 500 g. A primeira porção será dada em jejum (pelo menos 8 horas para alimentação e 6 horas para bebida) e em duas porções separadas (cada uma com 250 g). Quando os participantes tiverem comido a primeira porção de 250 g, o sujeito receberá 0,25 mg de 67Zn diluído em 50 ml de água mineral e, em seguida, os participantes receberão a segunda porção de batata. Duas horas depois, os participantes receberão uma infusão intravenosa de 70Zn (200 ug) diluído em 50 ml de água mineral. Após mais 2 horas, os participantes receberão as duas segundas porções de batata e, como antes, após a primeira porção, os participantes receberão 0,25 mg de 67Zn diluído em 50 ml de água engarrafada. Durante este período e por 3 horas após a segunda porção de batata o sujeito não consumirá nenhum alimento ou líquido, exceto água que será fornecida aos participantes. Cada sujeito receberá 200 ml de água em cada refeição e 200 ml de água entre as refeições. Atualmente, o uso de isótopos é o melhor método para medir a absorção de zinco. Além disso, os isótopos que serão utilizados são isótopos estáveis, ou seja, os participantes existem naturalmente no ambiente e não representam nenhum risco. Nenhum alimento ou bebida pode ser consumido por pelo menos 3 horas após comer a porção final da batata.

Amostras de sangue para medição de zinco Os investigadores irão coletar um total de três amostras de sangue. Absorção por isótopos estáveis ​​(dia 29) As amostras de sangue coletadas serão enviadas para ETH, Zurique. A ETH fará a análise da PCR para Zinco. A PCR será medida usando um kit ELISA. A concentração plasmática de zinco será medida por espectrometria de massa acoplada a plasma de indução.

Amostras de urina para medição de zinco usando isótopos estáveis ​​Amostras de urina serão concentradas usando liofilização e depois mineralizadas por digestão em forno de micro-ondas (MLS-Turbowave; MLS GmbH) usando uma mistura de HNO3 e zinco isolado da matriz mestre por troca iônica cromatografia. Os investigadores usarão ácidos ultrapuros para a preparação das amostras.

Determinação da absorção de zinco O sangue e a composição isotópica do zinco serão analisados ​​em duplicata no Laboratório de Nutrição Humana da ETH. Amostras de urina serão mineralizadas por digestão por micro-ondas (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) usando uma mistura de HNO3 e H2O2 e zinco isolado da matriz da amostra por cromatografia de troca iônica (Wegmuller et al 2014). Todos os ácidos utilizados para a preparação das amostras serão ultrapuros. As razões isotópicas de 70Zn:66Zn e 67Zn:66Zn serão medidas para determinar o enriquecimento de 70Zn e 67Zn nas amostras de urina usando um espectrômetro de massa de plasma indutivamente acoplado a campo de setor magnético de dupla focagem e alta resolução (Finnigan Neptune; Thermo Electron). 12 A absorção fracionada da dose de 67Zn das refeições de teste será calculada usando a via oral para i.v. método da proporção de traçadores aplicado a amostras spot de urina, de acordo com os princípios descritos por Friel et al.

Registro alimentar de 7 dias Usando o método de registro de todos os alimentos consumidos durante um período de 7 dias, os investigadores podem obter informações sobre todos os alimentos consumidos em uma semana (incluindo sábado e domingo). Para conseguir isso, os investigadores pedirão aos participantes que façam um registro de todos os alimentos consumidos, detalhes da preparação dos alimentos e todas as bebidas (incluindo água) que os participantes comeram ou beberam. O participante deveria anotar a refeição em que consumiu o alimento e a bebida, o horário de consumo (café da manhã, almoço, jantar e entre as refeições (lanches) e a quantidade ingerida em cada horário do dia. Para tal os investigadores entregarão aos sujeitos um tablet para registarem os consumos/refeições e também tirarão uma fotografia de todos os alimentos ingeridos.

MÉTODOS ESPECÍFICOS PARA AVALIAÇÃO DE IMPACTO Os dados sobre ingestão dietética, ferritina sérica e biodisponibilidade de ferro serão usados ​​para duas abordagens de modelagem. Em primeiro lugar, os investigadores aplicarão o método Ano de Vida Ajustado por Incapacidade (DALY), que é um método apropriado para estimar os impactos nutricionais e de saúde das culturas biofortificadas. Isso se baseará em modelos que foram desenvolvidos em conjunto pelo CIP e pelo IIN, que fizeram suposições sobre a biodisponibilidade de ferro e zinco das batatas. Em segundo lugar, os pesquisadores usarão dados sobre ingestão habitual de ferro, concentrações séricas de ferritina e necessidades fisiológicas calculadas de ferro para adaptar um modelo de estimativa da biodisponibilidade dietética de ferro na Europa, na região montanhosa dos Andes e, de maneira mais geral, em países de baixa e média renda.