Jern og sink biotilgjengelighet fra bioforsterkede poteter

Type studie og populasjon Dobbeltblind randomisert studie av naturlig biofortifiserte poteter som skal utføres i Huancavelica, Perú. Det vil bli rekruttert rundt 100 kvinner og 80 menn i alderen 18-45 år som bor i byen Huancavelica.

ETIKK Søknader ble sendt inn og godkjent av Research Ethics Committee (REC) ved University of East Anglia Fakultet for medisin og helse (FMH) i Norwich (UK) og en REC ved Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) i Peru.

Hver deltaker vil bli fullstendig informert om alle prosedyrene og vil få muligheten til å stille spørsmål og motta ytterligere detaljer deltakerne trenger.

Prosedyrene (blodprøver, urinprøver, antropometri, tilbakekalling av kosthold) vil bli forklart til personene som godtar å delta i den innledende screeningen, og deltakerne vil bli invitert til å signere det første samtykkeskjemaet.

SPESIFIKKE METODER FOR JERNSTUDIE (Fase 1) Prøvestørrelse Studien krever en registrering av totalt 30 kvinner for å tillate at 33 % som ikke følger protokollen, kan nå en endelig prøvestørrelse på 20 kvinner. Etterforskerne anslår at etterforskerne kan trenge å screene rundt 100 kvinner.

Ernæringsstatus Som en del av screeningen vil alle potensielle kandidater bli veid og målt ved bruk av standardisert utstyr.

Måling av fysisk aktivitet Alle deltakerne vil bli bedt om å bruke en actigraph (et tri-aksialt akselerometer) som måler fysisk aktivitet (bevegelse) i tre dimensjoner.

Blodprøve Et passende opplært medlem av studieteamet vil samle en venøs blodprøve (ca. 6 ml i et reagensrør med heparin) for å måle ferritin, hemoglobin og CRP (screening og 3 ganger til: baseline, 16 og 40 dager etter første dag av potetinntak).

Urinprøve Deltakerne vil bli bedt om å gi en urinprøve (30 ml) for å utføre en graviditetstest med en teststrimmel.

Sosiodemografisk og matsikkerhetsundersøkelse Etterforskerne vil inkludere en sosioøkonomisk undersøkelse og ELCSA matsikkerhetsspørreskjemaet vil begge bli brukt på alle påmeldte deltakere.

Studieprosedyrer I henhold til resultatene av screeningen og revisjonen av kriteriene for inkludering og ekskludering og etter informasjon og bekreftelse på at deltakerne forstår samtykkeskjemaet for jernstudier, vil forsøkspersonene bli invitert til å delta. Samtykkede deltakere vil bli tilfeldig tildelt til å konsumere en eller annen av de to potettypene (biofortifisert-A eller ikke-B). Den første potetsorten vil bli gitt i løpet av de første 2 ukene (dag 1-12) og den andre sekvensen mellom dag 15-26, (i begge tilfeller unntatt helgedager lørdag og søndag). Potetene skal kokes i vann og tilbys mos.

Blodprøver vil bli tatt ved 5 anledninger, 1) ved screening for å verifisere samsvar med eksklusjons- og inklusjonskriteriene; deretter på dag 1 før deltakerne spiser den første potettypen, dag 15 før de spiser den andre potettypen, dag 26 etter å ha spist alle begge potettypene og på dag 40 to uker etter å ha spist all poteten.

Forbruk av poteten Hver deltaker får servert 500 g potet fordelt på to porsjoner på 250 g hver. hver deltaker tar, avhengig av tildelingen, 0,3 mg 57FeSO4 (Peruanita-potet) eller 0,3 mg 58FeSO4 (biofortifisert potet), fortynnet i 50 ml destillert vann, som bør drikkes mens deltakerne spiser poteten - halvveis i måltid. I tillegg vil hver deltaker motta 200 ml destillert vann å drikke. Isotopene vil bli levert av ETH (Swiss Federal Institute of Technology i Zürich). I tillegg er isotopene som etterforskerne skal bruke stabile isotoper, det vil si at deltakere finnes naturlig i miljøet og som sådan ikke utgjør noen risiko.

Innsamling av biologiske prøver for måling av jern ved bruk av stabile isotoper Blodprøver vil bli tatt gjennom intervensjonsperioden som tidligere beskrevet og vil bli sendt til ETH, Zürich, etter standard operasjonsprosedyrer. Deltakerne vil bli informert og vil gi samtykke til overføring og bruk av prøvene deres utenfor Peru for formålet med denne forskningsstudien. Prøver vil bli anonymisert og vil ikke bli transportert med personlig identifiserbar data.

Når det gjelder prosessering, vil prøver blandes med NO3 og H2O2 og fordøyes i en mikrobølgeovn, etterfulgt av separasjon av jernet fra blodmatrisen ved hjelp av bytte-anionkromatografi og et løsningsmiddel (fortynningsmiddel) eller ekstraksjon fra løsningsmidlet ved bruk av destillert.

Isotopene vil bli analysert ved hjelp av et plasmakoblet induktivt multikollektor massespektrometer (Neptune; Thermo Finnigan). Mengden av de merkede jernisotopene 57Fe og 58Fe vil bli målt 14 dager etter at inntak av begge potettyper er fullført. Beregningen (av absorpsjon) vil bli gjort med tanke på forsøkspersonens estimerte blodvolum basert på vekt, høyde og forsøkspersonens målte hemoglobinkonsentrasjon (med tanke på gjennomsnittet av den første og siste blodprøven). Beregningen er basert på prinsippet om isotopfortynning som vurderes som faktoren for jernisotopmarkøren i stedet for den monoisotopiske markøren8. For beregningen av den absorberte fraksjonen vil etterforskerne anta 80 % inkorporering av det absorberte jernet.

SPESIFIKKE METODER FOR SINKSTUDIE (Fase 2) Prøvestørrelse Studien krever en prøvestørrelse på 40 kvinner. Dette åpner for et tap på 40 % for å nå en endelig total på 24 kvinner.

Prosedyrer I henhold til resultatene av screening, og etter å ha kontrollert at deltakerne oppfyller alle inklusjonskriteriene og ingen av eksklusjonskriteriene vil deltakerne bli invitert til å delta i sinkdelen av studien. For denne deltakeren vil få det andre samtykkeskjemaet til å lese, og de som godtar og signerer skjemaet vil bli invitert til å delta i studien.

Personene som godtar vil bli tilfeldig fordelt til å spise en eller annen av potettypene (biofortifisert-A eller nei-B). Alle deltakerne vil få utdelt begge typer potet, men i ulik rekkefølge, på denne måten vil hver deltaker være sin egen kontroll. Den første potetsorten vil bli gitt på dag 1, etter aksept av deltakelse i studien, og etter å ha akseptert og signert samtykkeskjemaet for denne delen: (forbruksprotokoll og andre variant vil bli spist 29 dager etter (rekkefølgen på potetsorter) vil bli tilfeldig tildelt).

Etterforskerne vil ta blodprøver ved tre anledninger: innmelding og dag 1 og 29 (dagene da deltakerne spiser poteten) etter faste i 8 timer (mat) og 6 timer (væske).

Studiemålinger Antropometri Som en del av screeningen vil alle potensielle kandidater bli veid og målt ved bruk av standardisert utstyr. Ut fra vekt og BMI vil etterforskerne avgjøre om deltakerne er kvalifisert.

Samtykkede deltakere vil bli bedt om å gi en venøs blodprøve (ca. 10 ml i et reagensrør med heparin). Plasma og pakkede røde blodlegemer vil bli hentet fra blodprøvene og lagret ved <18oC.

Urinprøve Samtykke deltakere vil gi en urinprøve (30 ml) som en del av screeningsfasen for å gjennomføre en graviditetstest. På dag 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 og 36 vil etterforskerne samle urinprøver for å analysere sinkinnholdet. Hver dag trenger etterforskerne 100 ml urin, samlet om morgenen (mellom klokken 7-12 om morgenen).

Forbruk av poteten Forsøkspersonene får totalt 1000 g potet fordelt på to 500 g porsjoner. Den første porsjonen gis mens deltakerne faster (minst 8 timer for mat og 6 timer for drikke) og i to separate porsjoner (hver på 250 g). Når deltakerne har spist den første 250 g porsjonen, vil forsøkspersonen motta 0,25 mg 67Zn fortynnet i 50 ml flaskevann og deretter vil deltakerne motta den andre porsjonen med potet. To timer senere vil deltakerne motta en intravenøs infusjon av 70Zn (200 ug) fortynnet i 50 ml flaskevann. Etter ytterligere 2 timer vil deltakerne motta de to andre porsjonene med potet, og som før, etter den første serveringen vil deltakerne motta 0,25 mg 67Zn fortynnet i 50 ml flaskevann. I løpet av denne perioden og i 3 timer etter den andre porsjonen med potet vil forsøkspersonen ikke innta mat eller væske, bortsett fra vann som deltakerne får. Hvert forsøksperson vil få 200 ml vann til hvert måltid og 200 ml vann mellom måltidene. Foreløpig er bruk av isotoper den beste metoden for å måle absorpsjon av sink. I tillegg er isotopene som skal brukes stabile isotoper, det vil si at deltakere eksisterer naturlig i miljøet og utgjør ingen risiko. Ingen mat eller drikke kan inntas i minst 3 timer etter å ha spist den siste porsjonen potet.

Blodprøver for måling av sink Etterforskerne vil ta totalt tre blodprøver totalt. Absorpsjon ved bruk av stabile isotoper (Dag 29) Blodprøvene som er tatt vil bli sendt til ETH, Zürich. ETH vil foreta analysen av CRP for sink. CRP vil bli målt ved hjelp av et ELISA-sett. Plasmasinkkonsentrasjonen vil bli målt ved induksjonsplasmakoblet massespektrometri.

Urinprøver for måling av sink ved bruk av stabile isotoper. Urinprøver vil bli konsentrert ved hjelp av frysetørking og deretter mineralisert ved fordøyelse i en mikrobølgeovn (MLS-Turbowave; MLS GmbH) ved bruk av en blanding av HNO3 og sink isolert fra mastermatrisen ved ionebytting kromatografi. Etterforskerne vil bruke ultrarene syrer for å forberede prøvene.

Bestemmelse av sinkabsorpsjon Blod- og sinkisotopsammensetning vil bli analysert i duplikat ved ETH Human Nutrition Laboratory. Urinprøver vil bli mineralisert ved mikrobølgenedbryting (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) ved bruk av en blanding av HNO3 og H2O2 og sink isolert fra prøvematrisen ved ionebytterkromatografi (Wegmuller et al 2014). Alle syrer som brukes til forberedelse av prøver vil være ultrarene. 70Zn:66Zn og 67Zn:66Zn isotopforhold vil bli målt for å bestemme 70Zn og 67Zn anrikning i urinprøvene ved å bruke et høyoppløselig dobbeltfokuserende magnetisk sektorfelt multi-kollektor induktivt koblet plasmamassespektrometer (Finnigan Neptun; Thermo Electron). 12 Fraksjonell absorpsjon av 67Zn-dosen fra testmåltidene vil bli beregnet ved å bruke oral til i.v. tracers ratio-metode brukt på spot urinprøver, i henhold til prinsipper beskrevet av Friel et al.

7-dagers matregistrering Ved å bruke metoden for å registrere all mat spist over en 7-dagers periode kan etterforskerne få informasjon om all mat spist i løpet av en uke (inkludert lørdag og søndag). For å oppnå dette vil etterforskerne be forsøkspersonene om å lage en oversikt over all mat som konsumeres, detaljer om matlaging og alle drikker (inkludert vann) som deltakerne har spist eller drukket. Deltakerne bør notere måltidet maten og drikken ble inntatt ved, og tiden det tar å spise den (frokost, lunsj, kveldsmat og mellom måltidene (snacks) og mengden spist til hver tid på dagen. For å gjøre dette vil etterforskerne gi forsøkspersonene en nettbrett der de kan registrere forbruket/måltidene og i tillegg ta et bilde av all maten som er spist.

SPESIFIKKE METODER FOR KONSEKVENSANALYSE Dataene om kostinntak, serumferritin og biotilgjengelighet av jern vil bli brukt for to modelleringsmetoder. For det første vil etterforskerne bruke metoden Disability Adjusted Life Year (DALY), som er en passende metode for å estimere ernæringsmessige og helsemessige virkninger av biobefestede avlinger. Dette vil bygge på modeller som er utviklet i fellesskap av CIP og IIN som har gjort antagelser om jern og sink biotilgjengelighet fra poteter. For det andre vil etterforskerne bruke data om vanlig jerninntak, serumferritinkonsentrasjoner og beregnede fysiologiske krav til jern for å tilpasse et modellestimat kosttilgjengelighet for jern i Europa, Andesfjellsregionen og mer generelt til lav- og mellominntektsland.