Biodisponibilità di ferro e zinco da patate biofortificate

Tipo di studio e popolazione Sperimentazione randomizzata in doppio cieco di patate naturalmente biofortificate da effettuare a Huancavelica, Perú. Saranno reclutate circa 100 donne e 80 uomini di età compresa tra i 18 ei 45 anni residenti nella città di Huancavelica.

Le domande ETHICS sono state presentate e approvate dal Research Ethics Committee (REC) della University of East Anglia Faculty of Medicine and Health (FMH) a Norwich (UK) e da un REC dell'Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) in Perù.

Ogni partecipante sarà pienamente informato di tutte le procedure e avrà la possibilità di porre domande e ricevere ulteriori dettagli richiesti dai partecipanti.

Le procedure (prelievi di sangue, campioni di urina, antropometria, richiamo dietetico) saranno spiegate alle persone che accettano di partecipare allo screening iniziale e i partecipanti saranno invitati a firmare il modulo di primo consenso.

METODI SPECIFICI PER LO STUDIO DEL FERRO (Fase 1) Dimensione del campione Lo studio richiede l'arruolamento di un totale di 30 donne per consentire al 33% che non aderisce al protocollo di raggiungere una dimensione finale del campione di 20 donne. Gli investigatori stimano che gli investigatori potrebbero dover sottoporre a screening circa 100 donne.

Stato nutrizionale Nell'ambito dello screening, tutti i potenziali candidati verranno pesati e misurati utilizzando apparecchiature standardizzate.

Misurazione dell'attività fisica A tutti i partecipanti verrà chiesto di utilizzare un attigrafo (un accelerometro triassiale) che misura l'attività fisica (movimento) in tre dimensioni.

Campione di sangue Un membro adeguatamente addestrato del team dello studio raccoglierà un campione di sangue venoso (circa 6 ml in una provetta con eparina) per misurare ferritina, emoglobina e CRP (screening e altre 3 volte: basale, 16 e 40 giorni dopo il primo giorno del consumo di patate).

Campione di urina Ai partecipanti verrà chiesto di fornire un campione di urina (30 ml) per eseguire un test di gravidanza utilizzando una striscia reattiva.

Indagine sociodemografica e sulla sicurezza alimentare Gli investigatori includeranno un'indagine socioeconomica e il questionario ELCSA sulla sicurezza alimentare, entrambi verranno applicati a tutti i partecipanti iscritti.

Procedure dello studio In base ai risultati dello screening e della revisione dei criteri di inclusione ed esclusione e in seguito alle informazioni e alla verifica che i partecipanti hanno compreso il modulo di consenso allo studio del ferro, i soggetti saranno invitati a partecipare. I partecipanti autorizzati saranno assegnati in modo casuale a consumare uno o l'altro dei due tipi di patate (biofortificate-A o non-B). La prima varietà di patata verrà data durante le prime 2 settimane (giorni 1-12) e la seconda sequenza tra i giorni 15-26 (in entrambi i casi esclusi i giorni del fine settimana sabato e domenica). Le patate saranno cotte in acqua e offerte schiacciate.

Verranno prelevati campioni di sangue in 5 occasioni, 1) allo screening per verificare la conformità con i criteri di esclusione e inclusione; poi il giorno 1 prima che i partecipanti mangiassero il primo tipo di patata, il giorno 15 prima di mangiare il secondo tipo di patata, il giorno 26 dopo aver mangiato tutti e due i tipi di patate e il giorno 40 due settimane dopo aver mangiato tutta la patata.

Consumo della patata Ad ogni partecipante verranno serviti 500 g di patata suddivisa in due porzioni da 250 g ciascuna. ogni partecipante assumerà, a seconda della propria assegnazione, 0,3 mg di 57FeSO4 (patata Peruanita) o 0,3 mg di 58FeSO4 (patata biofortificata), diluiti in 50 ml di acqua distillata, che dovranno essere bevuti mentre i partecipanti stanno mangiando la patata - a metà del pasto. Inoltre, ogni partecipante riceverà 200 ml di acqua distillata da bere. Gli isotopi saranno forniti dall'ETH (Swiss Federal Institute of Technology di Zurigo). Inoltre, gli isotopi che i ricercatori utilizzeranno sono isotopi stabili, cioè i partecipanti esistono naturalmente nell'ambiente e come tali non presentano alcun rischio.

Raccolta di campioni biologici per la misurazione del ferro mediante isotopi stabili I campioni di sangue saranno raccolti durante tutto il periodo di intervento come precedentemente descritto e saranno inviati all'ETH, Zurigo, seguendo le procedure operative standard. I partecipanti saranno informati e forniranno il consenso per il trasferimento e l'uso dei loro campioni al di fuori del Perù ai fini di questo studio di ricerca. I campioni saranno resi anonimi e non saranno trasportati con dati personali identificabili.

In termini di elaborazione, i campioni saranno miscelati con NO3 e H2O2 e digeriti in un forno a microonde, seguita dalla separazione del ferro dalla matrice del sangue mediante cromatografia anionica di scambio e un solvente (diluente) o estrazione dal solvente utilizzando distillato.

Gli isotopi saranno analizzati utilizzando uno spettrometro di massa multicollettore induttivo accoppiato al plasma (Neptune; Thermo Finnigan). La quantità degli isotopi di ferro etichettati 57Fe e 58Fe sarà misurata 14 giorni dopo il completamento del consumo di entrambi i tipi di patate. Il calcolo (dell'assorbimento) verrà effettuato considerando il volume sanguigno stimato del soggetto in base al peso, all'altezza e alla concentrazione di emoglobina misurata dal soggetto (considerando la media del campione di sangue iniziale e finale). Il calcolo si basa sul principio della diluizione isotopica considerando come fattore per il marcatore isotopico del ferro piuttosto che per il marcatore monoisotopico8. Per il calcolo della frazione assorbita i ricercatori assumeranno l'incorporazione dell'80% del ferro assorbito.

METODI SPECIFICI PER LO STUDIO SULLO ZINCO (Fase 2) Dimensione del campione Lo studio richiede una dimensione del campione di 40 donne. Ciò consente una perdita del 40% per raggiungere un totale finale di 24 donne.

Procedure In base ai risultati dello screening e dopo aver verificato che i partecipanti soddisfino tutti i criteri di inclusione e nessuno dei criteri di esclusione, i partecipanti saranno invitati a partecipare alla parte zinco dello studio. Per questo partecipante verrà dato il secondo modulo di consenso da leggere e coloro che accettano e firmano il modulo saranno invitati a partecipare allo studio.

Le persone che accetteranno saranno assegnate in modo casuale a mangiare uno o l'altro dei tipi di patate (biofortificate-A o no-B). A tutti i partecipanti verranno dati entrambi i tipi di patata ma in ordine diverso, in questo modo ogni partecipante avrà il proprio controllo. La prima varietà di patate verrà data il giorno 1, dopo aver accettato di partecipare allo studio, e dopo aver accettato e firmato il modulo di consenso per questa parte: (protocollo di consumo e la seconda varietà sarà consumata 29 giorni dopo (l'ordine delle varietà di patate saranno assegnati casualmente).

Gli investigatori preleveranno campioni di sangue in tre occasioni: iscrizione e giorni 1 e 29 (i giorni in cui i partecipanti mangiano la patata) dopo il digiuno per 8 ore (cibo) e 6 ore (liquidi).

Misurazioni dello studio Antropometria Come parte dello screening, tutti i potenziali candidati saranno pesati e misurati utilizzando apparecchiature standardizzate. In base al loro peso e BMI gli investigatori decideranno se i partecipanti sono idonei.

Ai partecipanti autorizzati verrà chiesto di fornire un campione di sangue venoso (circa 10 ml in una provetta con eparina). Il plasma e gli eritrociti concentrati saranno ottenuti dai campioni di sangue e conservati a <18oC.

Campione di urina I partecipanti autorizzati forniranno un campione di urina (30 ml) come parte della fase di screening per eseguire un test di gravidanza. Nei giorni 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 e 36 gli investigatori raccoglieranno campioni di urina per analizzare il contenuto di zinco. Ogni giorno gli investigatori hanno bisogno di 100 ml di urina, raccolti al mattino (tra le 7 e le 12 del mattino).

Consumo della patata Ai soggetti verranno dati in totale 1000 g di patata in due porzioni da 500 g. La prima porzione verrà data a digiuno dai partecipanti (almeno 8 ore per il cibo e 6 ore per la bevanda) e in due porzioni separate (ciascuna da 250 g). Quando i partecipanti avranno mangiato la prima porzione da 250 g, il soggetto riceverà 0,25 mg di 67Zn diluito in 50 ml di acqua in bottiglia e poi i partecipanti riceveranno la seconda porzione di patate. Due ore dopo, i partecipanti riceveranno un'infusione endovenosa di 70Zn (200 ug) diluito in 50 ml di acqua in bottiglia. Dopo altre 2 ore i partecipanti riceveranno le seconde due porzioni di patate e, come prima, dopo la prima porzione i partecipanti riceveranno 0,25 mg di 67Zn diluiti in 50 ml di acqua in bottiglia. Durante questo periodo e per le 3 ore successive alla seconda porzione di patata il soggetto non consumerà alcun alimento o liquido, ad eccezione dell'acqua di cui verrà fornita ai partecipanti. Ogni soggetto riceverà 200 ml di acqua ad ogni pasto e 200 ml di acqua tra i pasti. Attualmente, l'utilizzo di isotopi è il metodo migliore per misurare l'assorbimento dello zinco. Inoltre, gli isotopi che verranno utilizzati sono isotopi stabili, cioè i partecipanti esistono naturalmente nell'ambiente e non presentano alcun rischio. Nessun cibo o bevanda può essere consumato per almeno 3 ore dopo aver mangiato l'ultima porzione di patata.

Campioni di sangue per la misurazione dello zinco Gli investigatori preleveranno un totale di tre campioni di sangue in totale. Assorbimento mediante isotopi stabili (Giorno 29) I campioni di sangue prelevati verranno inviati all'ETH di Zurigo. ETH intraprenderà l'analisi della CRP per lo zinco. La CRP verrà misurata utilizzando un kit ELISA. La concentrazione plasmatica di zinco sarà misurata mediante spettrometria di massa accoppiata al plasma ad induzione.

Campioni di urina per la misurazione dello zinco utilizzando isotopi stabili I campioni di urina saranno concentrati mediante liofilizzazione e quindi mineralizzati mediante digestione in un forno a microonde (MLS-Turbowave; MLS GmbH) utilizzando una miscela di HNO3 e zinco isolati dalla matrice principale mediante scambio ionico cromatografia. Gli investigatori utilizzeranno acidi ultrapuri per la preparazione dei campioni.

Determinazione dell'assorbimento di zinco La composizione isotopica del sangue e dello zinco sarà analizzata in duplicato presso il laboratorio di nutrizione umana dell'ETH. I campioni di urina saranno mineralizzati mediante digestione a microonde (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) utilizzando una miscela di HNO3 e H2O2 e zinco isolato dalla matrice del campione mediante cromatografia a scambio ionico (Wegmuller et al 2014). Tutti gli acidi utilizzati per la preparazione dei campioni saranno ultrapuri. I rapporti isotopici 70Zn:66Zn e 67Zn:66Zn saranno misurati per determinare l'arricchimento di 70Zn e 67Zn nei campioni di urina utilizzando uno spettrometro di massa al plasma accoppiato induttivamente con campo magnetico a doppia focalizzazione ad alta risoluzione (Finnigan Neptune; Thermo Electron). 12 L'assorbimento frazionale della dose di 67Zn dai pasti di prova sarà calcolato utilizzando la somministrazione da orale a i.v. metodo del rapporto dei traccianti applicato a campioni di urina spot, secondo i principi descritti da Friel et al.

Registro alimentare di 7 giorni Utilizzando il metodo di registrazione di tutti gli alimenti consumati in un periodo di 7 giorni, i ricercatori possono ottenere informazioni su tutti gli alimenti consumati in una settimana (inclusi sabato e domenica). Per raggiungere questo obiettivo, gli investigatori chiederanno ai soggetti di registrare tutti gli alimenti consumati, i dettagli della preparazione del cibo e tutte le bevande (inclusa l'acqua) che i partecipanti hanno mangiato o bevuto. I partecipanti devono annotare il pasto durante il quale il cibo e la bevanda sono stati consumati, il tempo impiegato per consumarlo (colazione, pranzo, cena e tra i pasti (spuntini) e la quantità consumata in ogni momento della giornata. Per fare questo gli investigatori daranno ai soggetti un tablet in cui registrare il consumo/pasti e anche scattare una foto di tutto il cibo mangiato.

METODI SPECIFICI PER LA VALUTAZIONE DELL'IMPATTO I dati sull'assunzione alimentare, la ferritina sierica e la biodisponibilità del ferro saranno utilizzati per due approcci di modellazione. In primo luogo, i ricercatori applicheranno il metodo Disability Adjusted Life Year (DALY), che è un metodo appropriato per stimare gli impatti nutrizionali e sulla salute delle colture biofortificate. Questo si baserà su modelli sviluppati congiuntamente da CIP e IIN che hanno formulato ipotesi sulla biodisponibilità di ferro e zinco dalle patate. In secondo luogo, i ricercatori utilizzeranno i dati sull'assunzione abituale di ferro, le concentrazioni di ferritina sierica e i fabbisogni fisiologici calcolati per il ferro per adattare un modello di stima della biodisponibilità dietetica del ferro in Europa, nella regione degli altipiani andini e, più in generale, nei paesi a basso e medio reddito.