Biodostępność żelaza i cynku z biofortyfikowanych ziemniaków

Rodzaj badania i populacja Podwójnie ślepa, randomizowana próba naturalnie biofortyfikowanych ziemniaków, która zostanie przeprowadzona w Huancavelica, Peru. Zrekrutowanych zostanie około 100 kobiet i 80 mężczyzn w wieku 18-45 lat mieszkających w mieście Huancavelica.

ETYKA Wnioski zostały złożone i zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań (REC) Wydziału Medycyny i Zdrowia (FMH) Uniwersytetu Wschodniej Anglii w Norwich (Wielka Brytania) oraz Komisję ds. Etyki w Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) w Peru.

Każdy uczestnik zostanie w pełni poinformowany o wszystkich procedurach i będzie miał możliwość zadawania pytań i uzyskania wszelkich dalszych szczegółów, których potrzebują uczestnicy.

Procedury (pobieranie krwi, moczu, antropometria, wywiad dietetyczny) zostaną wyjaśnione osobom, które wyrażą zgodę na wstępną selekcję, a uczestnicy zostaną poproszeni o podpisanie pierwszego formularza zgody.

SPECYFICZNE METODY DLA BADANIA ŻELAZA (Faza 1) Wielkość próby Badanie wymaga włączenia łącznie 30 kobiet, aby pozwolić 33%, które nie przestrzegają protokołu, osiągnąć ostateczną wielkość próby 20 kobiet. Badacze szacują, że mogą potrzebować przebadać około 100 kobiet.

Stan odżywienia W ramach badania przesiewowego wszyscy potencjalni kandydaci zostaną zważeni i zmierzeni przy użyciu standardowego sprzętu.

Pomiar aktywności fizycznej Wszyscy uczestnicy zostaną poproszeni o skorzystanie z aktygrafu (trójosiowego akcelerometru), który mierzy aktywność fizyczną (ruch) w trzech wymiarach.

Próbka krwi Odpowiednio przeszkolony członek zespołu badawczego pobierze próbkę krwi żylnej (około 6 ml w probówce z heparyną) w celu oznaczenia ferrytyny, hemoglobiny i CRP (badanie przesiewowe i jeszcze 3 razy: wyjściowa, 16 i 40 dni po pierwszym dniu spożycia ziemniaków).

Próbka moczu Uczestnicy zostaną poproszeni o oddanie próbki moczu (30ml) w celu wykonania testu ciążowego za pomocą paska testowego.

Ankieta socjodemograficzna i bezpieczeństwa żywnościowego Badacze przeprowadzą ankietę socjoekonomiczną i kwestionariusz bezpieczeństwa żywnościowego ELCSA, które zostaną zastosowane do wszystkich zapisanych uczestników.

Procedury badawcze Zgodnie z wynikami selekcji i rewizji kryteriów włączenia i wyłączenia oraz po uzyskaniu informacji i weryfikacji, że uczestnicy rozumieją formularz zgody na badanie żelaza, uczestnicy zostaną zaproszeni do udziału. Uczestnicy, którzy wyrażą zgodę, zostaną losowo przydzieleni do spożycia jednego lub drugiego z dwóch rodzajów ziemniaków (biofortyfikowanego A lub nie-B). Pierwsza odmiana ziemniaka zostanie podana w ciągu pierwszych 2 tygodni (dzień 1-12), a druga sekwencja między dniami 15-26 (w obu przypadkach z wyłączeniem dni weekendowych, sobót i niedziel). Ziemniaki będą gotowane w wodzie i podawane jako puree.

Próbki krwi zostaną pobrane 5 razy, 1) podczas badania przesiewowego w celu sprawdzenia zgodności z kryteriami wykluczenia i włączenia; następnie w dniu 1 przed zjedzeniem przez uczestników pierwszego rodzaju ziemniaków, dnia 15 przed zjedzeniem drugiego rodzaju ziemniaków, dnia 26 po zjedzeniu wszystkich rodzajów ziemniaków i dnia 40 dwa tygodnie po zjedzeniu wszystkich ziemniaków.

Spożycie ziemniaka Każdemu uczestnikowi zostanie podane 500 g ziemniaka podzielone na dwie porcje po 250 g każda. każdy uczestnik pobierze, w zależności od przydziału, 0,3 mg 57FeSO4 (ziemniak Peruanita) lub 0,3 mg 58FeSO4 (ziemniak biofortyfikowany) rozcieńczonego w 50 ml wody destylowanej, którą należy wypić w trakcie jedzenia ziemniaka – w połowie posiłek. Dodatkowo każdy uczestnik otrzyma 200 ml wody destylowanej do picia. Izotopy dostarczy ETH (Szwajcarski Federalny Instytut Technologii w Zurychu). Ponadto izotopy, których użyją badacze, są izotopami stabilnymi, to znaczy uczestnicy występują naturalnie w środowisku i jako tacy nie stanowią żadnego zagrożenia.

Pobieranie próbek biologicznych do pomiaru żelaza przy użyciu stabilnych izotopów Próbki krwi będą pobierane przez cały okres interwencji zgodnie z wcześniejszym opisem i wysyłane do ETH w Zurychu zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi. Uczestnicy zostaną poinformowani i wyrażą zgodę na przekazanie i wykorzystanie ich próbek poza Peru do celów niniejszego badania. Próbki zostaną zanonimizowane i nie będą transportowane z danymi osobowymi.

W zakresie przetwarzania próbki zostaną zmieszane z NO3 i H2O2 i poddane trawieniu w kuchence mikrofalowej, a następnie oddzieleniu żelaza od macierzy krwi metodą chromatografii anionowo-wymiennej i rozpuszczalnika (rozcieńczalnik) lub ekstrakcji z rozpuszczalnika destylowanym.

Izotopy będą analizowane za pomocą spektrometru masowego ze sprzężeniem plazmowym z wieloma kolektorami indukcyjnymi (Neptune; Thermo Finnigan). Ilość znakowanych izotopów żelaza 57Fe i 58Fe zostanie zmierzona po 14 dniach od zakończenia spożycia obu rodzajów ziemniaków. Obliczenie (wchłaniania) zostanie wykonane z uwzględnieniem szacowanej objętości krwi osobnika na podstawie wagi, wzrostu i zmierzonego stężenia hemoglobiny osobnika (biorąc pod uwagę średnią z początkowej i końcowej próbki krwi). Obliczenia opierają się na zasadzie rozcieńczenia izotopowego, biorąc pod uwagę czynnik znacznika izotopu żelaza, a nie znacznika monoizotopu8. Do obliczenia frakcji wchłoniętej badacze przyjmą 80% wchłonięcia żelaza.

SPECYFICZNE METODY BADANIA CYNKU (faza 2) Wielkość próby Badanie wymaga próby obejmującej 40 kobiet. Pozwala to na utratę 40%, aby osiągnąć ostateczną liczbę 24 kobiet.

Procedury Zgodnie z wynikami selekcji i po sprawdzeniu, czy uczestnicy spełniają wszystkie kryteria włączenia i żadne z kryteriów wykluczenia, uczestnicy zostaną zaproszeni do udziału w cynkowej części badania. W tym celu uczestnik otrzyma drugi formularz zgody do przeczytania, a osoby, które zaakceptują i podpiszą formularz, zostaną zaproszone do udziału w badaniu.

Osoby, które zaakceptują, zostaną losowo przydzielone do zjedzenia jednego lub drugiego rodzaju ziemniaków (biofortyfikowanych-A lub nie-B). Wszyscy uczestnicy otrzymają oba rodzaje ziemniaków, ale w innej kolejności, w ten sposób każdy uczestnik będzie miał własną kontrolę. Pierwsza odmiana ziemniaka zostanie podana w dniu 1, po akceptacji udziału w badaniu oraz po zaakceptowaniu i podpisaniu zgody na tę część: (protokół spożycia i druga odmiana zostaną spożyte po 29 dniach (kolejność odmian ziemniaka zostanie przydzielony losowo).

Badacze pobiorą próbki krwi trzykrotnie: podczas rejestracji oraz w dniach 1 i 29 (dni, w których uczestnicy jedzą ziemniaka) po poście trwającym 8 godzin (jedzenie) i 6 godzin (płyny).

Badanie Pomiary Antropometria W ramach badania przesiewowego wszyscy potencjalni kandydaci zostaną zważeni i zmierzeni przy użyciu standardowego sprzętu. Na podstawie ich wagi i BMI badacze zdecydują, czy uczestnicy się kwalifikują.

Osoby, które wyrażą zgodę zostaną poproszone o pobranie próbki krwi żylnej (około 10 ml w probówce z heparyną). Z próbek krwi pobrane zostanie osocze i koncentrat krwinek czerwonych, które będą przechowywane w temperaturze <18oC.

Próbka moczu Uczestnicy, którzy wyrazili zgodę, pobiorą próbkę moczu (30 ml) w ramach fazy przesiewowej w celu przeprowadzenia testu ciążowego. W dniach 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 i 36 badacze pobiorą próbki moczu do analizy zawartości cynku. Każdego dnia badacze potrzebują 100 ml moczu, pobieranego rano (między 7-12 rano).

Spożycie ziemniaków Badani otrzymają łącznie 1000 g ziemniaków w dwóch porcjach po 500 g. Pierwsza porcja zostanie podana na czczo (co najmniej 8 godzin na jedzenie i 6 godzin na picie) oraz w dwóch oddzielnych porcjach (każda po 250 g). Po zjedzeniu przez uczestników pierwszej porcji 250 g badany otrzyma 0,25 mg 67Zn rozcieńczonego w 50 ml butelkowanej wody, a następnie uczestnicy otrzymają drugą porcję ziemniaków. Dwie godziny później uczestnicy otrzymają dożylny wlew 70Zn (200 μg) rozpuszczonego w 50 ml butelkowanej wody. Po kolejnych 2 godzinach uczestnicy otrzymają drugie dwie porcje ziemniaków i tak jak poprzednio po pierwszej porcji uczestnicy otrzymają 0,25 mg 67Zn rozpuszczonego w 50 ml butelkowanej wody. W tym czasie oraz przez 3 godziny po drugiej porcji ziemniaków badany nie będzie spożywał żadnych pokarmów ani płynów, z wyjątkiem wody, którą uczestnicy zostaną zaopatrzeni. Każdy pacjent otrzyma 200 ml wody do każdego posiłku i 200 ml wody pomiędzy posiłkami. Obecnie najlepszą metodą pomiaru wchłaniania cynku jest użycie izotopów. Ponadto izotopy, które zostaną użyte, są izotopami stabilnymi, co oznacza, że ​​uczestnicy występują naturalnie w środowisku i nie stanowią żadnego zagrożenia. Przez co najmniej 3 godziny po zjedzeniu ostatniej porcji ziemniaka nie można jeść ani pić.

Próbki krwi do pomiaru cynku Badacze pobiorą w sumie trzy próbki krwi. Absorpcja przy użyciu stabilnych izotopów (dzień 29) Pobrane próbki krwi zostaną wysłane do ETH w Zurychu. ETH podejmie się analizy CRP dla cynku. CRP będzie mierzone za pomocą zestawu ELISA. Stężenie cynku w osoczu będzie mierzone metodą spektrometrii mas sprzężonej z plazmą indukcyjną.

Próbki moczu do pomiaru cynku przy użyciu stabilnych izotopów Próbki moczu zostaną zatężone przy użyciu liofilizacji, a następnie zmineralizowane poprzez roztwarzanie w kuchence mikrofalowej (MLS-Turbowave; MLS GmbH) przy użyciu mieszaniny HNO3 i cynku wyizolowanych z matrycy wzorcowej metodą wymiany jonowej chromatografia. Do przygotowania próbek badacze użyją ultraczystych kwasów.

Oznaczanie wchłaniania cynku Skład izotopowy krwi i cynku będzie analizowany w dwóch egzemplarzach w Laboratorium Żywienia Człowieka ETH. Próbki moczu będą mineralizowane przez trawienie mikrofalowe (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) przy użyciu mieszaniny HNO3 i H2O2 oraz cynku wyizolowanego z matrycy próbki metodą chromatografii jonowymiennej (Wegmuller i in. 2014). Wszystkie kwasy użyte do przygotowania próbek będą ultraczyste. Stosunki izotopowe 70Zn:66Zn i 67Zn:66Zn będą mierzone w celu określenia wzbogacenia w 70Zn i 67Zn w próbkach moczu przy użyciu spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości z podwójnym ogniskowaniem pola magnetycznego i wieloma kolektorami z plazmą sprzężoną indukcyjnie (Finnigan Neptune; Thermo Electron). 12 Wchłanianie frakcyjne dawki 67Zn z posiłków testowych zostanie obliczone na podstawie podania doustnego do i.v. metoda współczynnika znaczników zastosowana do punktowych próbek moczu, zgodnie z zasadami opisanymi przez Friela i in.

7-dniowa ewidencja żywności Wykorzystując metodę rejestracji wszystkich posiłków spożytych w okresie 7 dni, badacze mogą uzyskać informacje o wszystkich potrawach spożytych w ciągu tygodnia (włączając sobotę i niedzielę). Aby to osiągnąć, badacze poproszą badanych o sporządzenie rejestru wszystkich spożywanych pokarmów, szczegółów przygotowania posiłków i wszystkich napojów (w tym wody), które uczestnicy zjedli lub wypili. Uczestnicy powinni odnotować posiłek, podczas którego spożyli jedzenie i napój oraz czas potrzebny na jego spożycie (śniadanie, obiad, kolacja i między posiłkami (przekąski) oraz ilość spożytą o każdej porze dnia. W tym celu badacze dadzą badanym tablet, w którym będą rejestrować spożycie/posiłki, a także zrobią zdjęcie całego zjedzonego jedzenia.

SPECYFICZNE METODY OCENY WPŁYWU Dane dotyczące spożycia, ferrytyny w surowicy i biodostępności żelaza zostaną wykorzystane w dwóch podejściach do modelowania. Po pierwsze, badacze zastosują metodę roku życia skorygowanego niepełnosprawnością (DALY), która jest odpowiednią metodą szacowania wpływu biofortyfikowanych upraw na odżywianie i zdrowie. Będzie to opierać się na modelach opracowanych wspólnie przez CIP i IIN, które przyjęły założenia dotyczące biodostępności żelaza i cynku z ziemniaków. Po drugie, badacze wykorzystają dane dotyczące zwyczajowego spożycia żelaza, stężenia ferrytyny w surowicy i obliczonego zapotrzebowania fizjologicznego na żelazo, aby dostosować model szacunkowej biodostępności żelaza w diecie w Europie, regionie górskim Andów oraz, bardziej ogólnie, w krajach o niskich i średnich dochodach.