Role bariér v interakcích IgG-patogen na mukosálním povrchu v lidských dýchacích cestách (BARRIG)

Od nástupu technologie monoklonálních protilátek se terapeutické protilátky (Ab) osvědčily při léčbě různých onemocnění. Ab radikálně změnila management a léčbu smrtelných onemocnění, od non-Hodgkinova lymfomu po subtypy astmatu. Úspěch Ab je založen na jejich vysoké selektivitě, předvídatelné toxicitě a jedinečných farmakologických profilech, které jim poskytují výhody oproti lékům s malou molekulou. Výsledkem je, že Ab představuje nejrychleji rostoucí třídu bioterapeutik, přičemž pět z nich patří mezi nejprodávanější léky v USA.

Respirační choroby postihují miliony lidí na celém světě; čtyři nejčastější smrtelná onemocnění plic (pneumonie, tuberkulóza, rakovina plic a chronická obstrukční plicní nemoc [CHOPN]) jsou podle WHO v roce 2030 celosvětově zodpovědná za přibližně jedno z pěti úmrtí. Kromě předčasné úmrtnosti mají respirační onemocnění dramatický dopad na společnost, pokud jde o zdravotní postižení, náklady na zdravotní péči a ztrátu produktivity, což vyžaduje nové terapeutické postupy. S více než 100 molekulami pod klinickým hodnocením a tuctem protilátek (Ab), které získaly marketingové schválení, mají Ab obrovskou příležitost prospět pacientům s respiračními chorobami, včetně bronchiektázie. V současnosti jsou Ab indikovány jako alternativní nebo doplňkové strategie k protinádorovým, protizánětlivým a protiinfekčním činidlům, zejména k antibiotikům. Chování Ab závisí na jejich farmakodynamice (PD) a farmakokinetice (PK), které částečně závisí na jejich způsobu podání. Doposud se Ab pro respirační onemocnění podávají převážně intravenózně nebo subkutánně, což není optimální pro zajištění terapeutické koncentrace aktivního léčiva v plicích, zatímco léčivo vystavuje jiné orgány.

Pro léčbu respiračních onemocnění umožňuje inhalace přímo zacílit na dýchací cesty. Cílem inhalace je dodávat léčiva topicky – jako aerosol – nosem a/nebo ústy do místa jejich působení. Inhalace je zlatým standardem pro podávání léků s lokálním účinkem k léčbě astmatu nebo CHOPN. Inhalace poskytuje lepší terapeutický index pro některé léky, často vyžaduje nižší dávku ve srovnání s jinými cestami a je neinvazivní, čímž zlepšuje adherenci k léčbě a pohodlí pacienta. V současné době je většina (lokálních) inhalovaných léčiv malých molekul z různých tříd. Ab jsou obvykle IgG plné délky, což jsou velké heterodimerní proteiny (~150 kDa), které pasivně nedifundují přes buněčné bariéry. V současné době je většina Ab pro respirační onemocnění dodávána intravenózní cestou (i.v). I.v. cesta nemusí být pro Ab optimální v kontextu respiračního onemocnění, protože pouze malá část Ab se dostane do plic/dýchacích cest po i.v. injekce. Inhalace je atraktivní a proveditelná alternativní cesta pro topické dodávání Ab plné délky do plic. Ab dodané dýchacími cestami vykazují terapeutické odezvy a jsou většinou zadržovány v plicích s nízkou systémovou difúzí. Celkově tato zjištění naznačují, že inhalace může mít náskok před jinými cestami podání, pokud jsou Ab zamýšleny k působení v dýchacím traktu.

Navzdory teoretickým výhodám topického podávání Ab inhalací se na klinikách dosud zhmotnilo jen málo z těchto výhod. V současné době je několik Ab v klinickém vývoji pomocí inhalace, ale žádná dosud na klinikách. Tento nedostatek zdůrazňuje složitost vývoje inhalačních protilátek a poukazuje na přetrvávající překážky, které je třeba překonat. K zajištění úspěšného přechodu z preklinického na klinický vývoj je zapotřebí podrobné pochopení farmakologie inhalované Ab. Zejména ukládání Ab aerosolu během respiračních onemocnění může být modulováno biologickými bariérami, které mohou omezit nebo zabránit aerosolizované účinnosti Ab. V současnosti jsou události, ke kterým dochází poté, co se inhalovaná Ab uložila v dýchacích cestách, neúplně známy a vyžadují hlubší charakterizaci.

Necystická fibróza bronchiektázie (NCFB) je skupina hnisavých chronických onemocnění dýchacích cest různé etiologie. Klinicky je NFCB charakterizována abnormální, nevratnou dilatací průdušek, obstrukcí dýchacích cest, chronickým kašlem a zvýšenou produkcí sputa. Na patofyziologické úrovni hraje klíčovou roli chronický zánět, chronická bakteriální kolonizace dýchacích cest a zvýšená produkce hlenu v dýchacích cestách. Současná léčba mikrobiální kolonizace a/nebo akutních exacerbací NFCB se většinou opírá o vysoké dávky systémových antibiotik nebo antibiotik podávaných do dýchacích cest. Nízké dávky dlouhodobého azithromycinu se také často používají ke snížení zánětu dýchacích cest, symptomů a frekvence akutních exacerbací. Vzhledem k tomu, že antibiotika nemusí buď zlepšit symptomy, nebo řídit mikrobiální rezistenci, existuje potřeba nových léčebných postupů pro zlepšení clearance patogenů a snížení zánětu dýchacích cest.

Inhalační polyklonální imunoglobulin G (IgG) je nový terapeutický přístup pro NCFB. Očekává se, že inhalovaný IgG zprostředkuje příznivé účinky u NCFB díky své schopnosti snížit rozsah respiračních patogenů schopných infikovat dýchací trakt, snížit plicní zátěž stávajících bakteriálních populací, zlepšit mukociliární clearance obnovením funkcí epiteliálních buněk a snížit zánět plic . Soubory předklinických údajů skutečně ukázaly sníženou zátěž patogeny a související poškození buněk po infekci u hlodavců a primátů. V současné době probíhá studie fáze 1 u pacientů s NCFB a studie chronické toxikologie umožňující studii fáze 2, včetně denního a profylaktického podávání nebulizovaného IgG po dobu 6 měsíců u pacientů s NCFB (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

U NCFB může hlen dýchacích cest působit jako bariéra pro inhalované léky na rozhraní sliznice. Zatímco normální hlen se prezentuje jako tenká vrstva, která umožňuje IgG účinně difundovat do spodních tkání, hlen dýchacích cest v NCFB je přítomen ve zvýšeném množství a je abnormálně hustý. Zhoršení množství, struktury a fluidity hlenu během bronchiektázie tak může omezit penetraci inhalovaných Ab a jejich terapeutický potenciál. U pacientů s NCFB se také často vyskytuje chronická bakteriální kolonizace dýchacích cest a chronický zánět dýchacích cest charakterizovaný zvýšenou aktivitou proteázy. Často také trpí exacerbacemi, což jsou patogeny (zejména P. aeruginosa a virus chřipky) vyvolané epizodami zvýšených příznaků, které vyžadují lékařskou intervenci, často včetně podávání antibiotik. V kontextu nadměrného zánětu převyšuje množství proteáz neutralizační kapacitu endogenních inhibitorů proteáz. To může mít dramatický dopad na metabolismus inhalovaných Ab a omezit jejich účinnost. Předchozí zprávy skutečně ukazují, že proteolýza IgG zprostředkovaná elastázou pocházející z neutrofilů vede ke snížení anti-P. aeruginosa fagocytóza a zabíjení. Kromě endogenních enzymů (zejména serinové [od neutrofilů] a cysteinové [kathepsinové] proteázy) vylučují bakteriální patogeny, jako je P. aeruginosa, také proteázy, které mohou degradovat léky dodávané z dýchacích cest. Kromě toho, patogeny jako P. aeruginosa indukují expresi mucinu.

Během první studie in vitro jsme hodnotili bariérový efekt umělého hlenu s viskozitou v rozmezí hodnot naměřených u hlenu pocházejícího ze sputa pacientů s respiračním onemocněním. CEPR pozoroval významnou změnu mobility a difúze exogenně přidaného polyklonálního IgG (CSL Behring), v závislosti na viskozitě ASM. Důležité je, že CEPR také stanovil významné snížení schopnosti polyklonálního IgG vázat se na P. aeruginosa v přítomnosti viskózního hlenu ve srovnání s tekutým hlenem.

Cíle studia. Hlavním cílem je vyhodnotit vliv hlenu pocházejícího ze sputa pacientů s NCFB na vazbu polyklonálního IgG na Pseudomonas aeruginosa. Výsledky získané s hlenem pacientů NCFB budou porovnány s výsledky získanými za použití umělého hlenu. Sekundárními cíli je charakterizace 1) exogenní polyklonální mobility IgG a 2) stability v hlenu odvozeném ze sputa pacientů s NCFB. Kromě toho bude zkoumán vliv mikrobiální kolonizace dýchacích cest na farmakodynamiku IgG.

Návrh studie. Jedná se o explorativní, prospektivní, monocentrickou, průřezovou, intervenční studii s minimálními riziky a omezeními u pacientů s necystickou fibrózou bronchiektázie (NCFB), po níž následuje centrum vzácných plicních onemocnění a pulmonologické oddělení Fakultní nemocnice v Tours (CHRU Tours). Pacienti zařazení do studie budou pokračovat v obvyklém sledování. Obvyklý léčebný postup – diagnostický a/nebo terapeutický – nebude účastí ve studii měněn, kromě dodatečné mikrobiologické studie sputa jako součásti studie.

Tato studie se zaměří na analýzu biochemických a biofyzikálních vlastností terapeutického polyklonálního IgG preparátu v přítomnosti sputa izolovaného od pacientů s NCFB a konkrétněji na schopnost IgG rozpoznat cíl. Bude také hodnocena mobilita a stabilita IgG v hlenu dýchacích cest. Aby bylo možné spojit koncové body PD – měřené v CEPR – s klinicky relevantními parametry, bude odběr sputa doprovázen dokumentací v hlenu a krvi o mikrobiologických (virologické a bakteriologické analýzy) a zánětlivých (krevní přípravky, C-reaktivní protein) parametry - měřeno na CHRU Tours.

Rozbory v krevním kompartmentu budou provedeny s použitím dodatečného objemu krve odebrané v době návštěvy při respektování limitů a kontraindikací (v souladu s nařízením ze dne 4. dubna 2018 čl. L.1121-1 HS kód). Analýza v dýchacích cestách bude provedena pomocí sputa odebraného pacientům. Pro každého pacienta zařazeného do studie bude naplánován jeden bod analýzy.

Měření výsledku. Hlavním výsledkem je kvantifikace vazby polyklonálního IgG na Pseudomonas aeruginosa v přítomnosti hlenu pocházejícího ze sputa pacientů s NCFB. Vazba bude hodnocena celobuněčnou ELISA.

Výsledky budou vyjádřeny jako procento vazby oproti vazbě získané po přidání polyklonálního IgG ve fyziologickém roztoku a budou porovnány s umělými mukózními přípravky v rozsahu viskozity podobnému hlenu z lidských dýchacích cest.

Sekundární výsledky jsou: (1) měření proteolýzy pomocí Western-Blot exogenního polyklonálního IgG přidaného do hlenu pocházejícího ze sputa pacientů s NCFB. Výsledky budou vyjádřeny jako procento integrity oproti výsledkům získaným, když je polyklonální IgG přidán do fyziologického roztoku a budou porovnány s výsledky in vitro; (2) měření mobility exogenního fluorescenčně značeného polyklonálního IgG přidaného do hlenu pocházejícího ze sputa pacientů s NCFB pomocí FRAP. Výsledky budou zahrnovat stanovení t(1/2), mobilní a nepohyblivé frakce nad frakcí získanou po přidání polyklonálního IgG do fyziologického roztoku a budou porovnány s výsledky in vitro. To bude provedeno v CEPR. (3) vliv mikrobiální kolonizace dýchacích cest na vazbu IgG, proteolýzu a mobilitu Ig. Vzorky s mikrobiální kolonizací (buď bakteriální, virovou nebo plísňovou) budou porovnány s nekolonizovanými vzorky.

Výběr a nábor lidí vhodných pro výzkum. Studijní populace zahrnuje všechny pacienty ve věku ≥ 18 let trpící NCFB a následuje centrum pro vzácná plicní onemocnění / Pneumologické oddělení CHRU Tours (aktivní seznam obsahuje 181 pacientů s idiopatickým NFCB v září 2023). Tito pacienti rutinně navštěvují kliniku včetně nucené spirometrie alespoň jednou ročně. V této průřezové studii budou pacienti vyšetřováni na základě lékařských záznamů z Centra vzácných plicních nemocí ve fakultní nemocnici v Tours (CHRU Bretonneau). Pacienti budou zejména vyšetřeni na chronickou tvorbu sputa. Odhaduje se, že do studie může být vhodná třetina všech pacientů. Způsobilým pacientům bude nabídnuta účast buď v době plánované návštěvy nemocnice, nebo telefonicky od výzkumného asistenta nebo výzkumné sestry. Pacientům se zájmem o studii bude poskytnut informační dokument pro další informace. Když pacienti dají ústní souhlas s účastí ve studii, budou pozváni na návštěvu do klinického vyšetřovacího centra (CIC Inserm 1415) nemocnice. Pacienti se poté setkají s vyšetřovatelem. Aby byl subjekt zapojen, musí splňovat všechna kritéria pro zařazení a žádná kritéria pro nezařazení. Souhlas potvrdí zkoušející po schůzce se subjektem a přezkoumání souhlasného dopisu.

Studijní návštěva. Při zařazení se pacient zúčastní návštěvy zkoušejícího, aby zaznamenal klinické vyšetření a vitální funkce, datum poslední akutní exacerbace, anamnézu, léčbu a respirační dotazník Saint George (míra kvality života). Popis bronchiektázií z nejnovější počítačové tomografie (CT), závažnost poškození plicních funkcí definovaná nejnovější spirometrií (FEV1) a index závažnosti bronchiektázií budou ověřeny starším pneumologem.

Sběr klinických dat.

Při zařazení se pacient zúčastní návštěvy zkoušejícího, aby zaznamenal:

• Lékařská anamnéza
• Současná léčba
• Klinické vyšetření a vitální funkce (krevní tlak, srdeční frekvence, perkutánní saturace hemoglobinu-SPO2 při dýchání vzduchu v místnosti)
• stupnice dušnosti mMRC
• Popis závažnosti bronchiektázie z nejnovějšího CT pomocí Bronchiektázie radiologicky indexovaného CT skóre (BRICS) a počtu zahrnutých laloků 19
• Závažnost poruchy proudění vzduchu (nucený výdech za 1 sekundu-FEV1) z poslední spirometrie. FEV1 je vyjádřena jako procento předpokládané hodnoty pomocí referenčních rovnic GLI2012
• Datum poslední akutní exacerbace (definované jako zvýšené respirační příznaky trvající > 48 hodin a nový předpis antibiotik)
• Počet a datum těžkých exacerbací vyžadujících hospitalizaci
• Počet akutních exacerbací vyžadujících antibiotickou léčbu za poslední rok
• Saint George's respirační dotazník (měřítko kvality života)
• Historie kolonizace dýchacích cest Pseudomonas nebo jinými bakteriemi

Odběr vzorků krve a inhalovaného sputa. Po lékařské konzultaci bude sestrou CIC odebráno 3x5 ml žilní krve pro hematologické a biochemické rozbory. 1 zkumavka bude použita pro imunologické analýzy provedené v CEPR.

Po odběru krve dostanou subjekty 0,9% aerosol NaCl, pokud je SPO2 při dýchání vzduchu v místnosti ≥94%, a budou odebrány vzorky indukovaného sputa. Klíčové kroky dodávání aerosolu a odběr sputa jsou:

• Pacient si vypláchne ústa pitnou vodou (pro snížení kontaminace vzorku slinami)
• Pacient smrká (pro snížení kontaminace vzorku hlenem z horních cest dýchacích)
• Začněte nebulizaci 15 ml 0,9% NaCl dodávaného pomocí pneumatického nebulizátoru (6 l/min vzduchu)
• Během a bezprostředně po aplikaci aerosolu NaCl se subjektu doporučuje alespoň 3x (5, 10, 15 minut) vykašlávání do 50ml zkumavky.

Analýza vzorku. Bezprostředně po odběru bude vzorek sputa odeslán na bakteriologické, virologické a mykologické oddělení CHRU Tours k charakterizaci mikrobiálních populací (Gramovo barvení a bakteriální kultury, barvení Gomori-Grocott a plísňové kultury, multiplexní RTPCR pro respirační patogeny). Zbývající vzorek sputa bude poté odeslán do CEPR k farmakologické analýze přípravku IgG. Nepoužité nebo zbylé vzorky budou uchovávány v CEPR ve specifické sbírce pro další experimentování. Budou uchovávány po neomezenou dobu.

Vzorky krve budou odeslány do hematologických a biochemických laboratoří pro stanovení počtu krvinek a stanovení C-reaktivního proteinu. 1 zkumavka bude použita k imunologické analýze (fenotypizace neutrofilů, měření celkového IgG) provedené v CEPR.

V rámci studie není plánováno žádné sledování subjektu.