Papel de las barreras en las interacciones IgG-patógeno en la superficie de la mucosa de las vías respiratorias humanas (BARRIG)

Desde la llegada de la tecnología de anticuerpos monoclonales, los anticuerpos terapéuticos (Ab) han demostrado ser exitosos para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Ab cambió radicalmente el manejo y tratamiento de enfermedades mortales, desde el linfoma no Hodgkin hasta subtipos de asma. El éxito de los Ab se basa en su alta selectividad, toxicidad predecible y perfiles farmacológicos únicos, lo que les otorga ventajas sobre los fármacos de moléculas pequeñas. Como resultado, Ab representa la clase de bioterapéuticos de más rápido crecimiento, con cinco de ellos entre los medicamentos más vendidos en los EE.UU.

Las enfermedades respiratorias afectan a millones de personas en todo el mundo; Las cuatro enfermedades pulmonares más comúnmente mortales (neumonía, tuberculosis, cáncer de pulmón y enfermedad pulmonar obstructiva crónica [EPOC]) representarán aproximadamente una de cada cinco muertes en todo el mundo en 2030, según la OMS. Además de la mortalidad prematura, las enfermedades respiratorias tienen un impacto dramático en la sociedad con respecto a la discapacidad, los costos de atención médica y la pérdida de productividad, lo que impulsa la necesidad de nuevas terapias. Con más de 100 moléculas bajo evaluación clínica y una docena de anticuerpos (Ab) que han recibido aprobación para su comercialización, los Ab tienen una gran oportunidad de beneficiar a los pacientes con enfermedades respiratorias, incluidas las bronquiectasias. Actualmente, los Ab están indicados como estrategias alternativas o complementarias a los agentes antitumorales, antiinflamatorios y antiinfecciosos, en particular a los antibióticos. El comportamiento de los Ac depende de su farmacodinamia (PD) y farmacocinética (PK), que en parte dependen de su vía de administración. Hasta ahora, los Ab para enfermedades respiratorias se administran principalmente por vía intravenosa o subcutánea, lo que no es óptimo para asegurar una concentración terapéutica del fármaco activo en los pulmones mientras expone otros órganos al fármaco.

Para el tratamiento de enfermedades respiratorias, la inhalación permite apuntar directamente al tracto respiratorio. La inhalación tiene como objetivo administrar los medicamentos por vía tópica (en forma de aerosol) a través de la nariz y/o la boca hasta su lugar de acción. La inhalación es el estándar de oro para la administración de fármacos de acción tópica para tratar el asma o la EPOC. La inhalación proporciona un mejor índice terapéutico para algunos fármacos, a menudo requiere una dosis reducida en comparación con otras vías y no es invasiva, lo que mejora la adherencia al tratamiento y la comodidad del paciente. Actualmente, la mayoría de los fármacos inhalados (tópicos) son moléculas pequeñas de diferentes clases. Los Ab suelen ser IgG de longitud completa, que son proteínas heterodiméricas grandes (~150 kDa) que no se difunden pasivamente a través de las barreras celulares. Actualmente, la mayoría de los Ab para enfermedades respiratorias se administran por vía intravenosa (i.v). La vía i.v. La ruta puede no ser óptima para Ab en el contexto de una enfermedad respiratoria, ya que solo una pequeña fracción de Ab llega a los pulmones/vías respiratorias después de la administración i.v. inyección. La inhalación es una ruta alternativa atractiva y factible para la administración tópica de Ab de longitud completa a los pulmones. Los Ab administrados a través de las vías respiratorias exhiben respuestas terapéuticas y en su mayoría se retienen en el pulmón con baja difusión sistémica. En general, estos hallazgos indican que la inhalación puede tener ventaja sobre otras vías de administración cuando los Ab están destinados a operar en el tracto respiratorio.

A pesar de las ventajas teóricas de la administración tópica de Ab por inhalación, pocos de estos beneficios se han materializado todavía en las clínicas. Actualmente hay varios Ab en desarrollo clínico por inhalación, pero ninguno todavía en las clínicas. Esta escasez pone de relieve la complejidad del desarrollo de anticuerpos inhalados y señala los obstáculos persistentes que hay que superar. Se requiere una comprensión detallada de la farmacología de los Ab inhalados para garantizar la transición exitosa del desarrollo preclínico al clínico. En particular, la deposición de aerosol de Ab durante enfermedades respiratorias puede estar modulada por barreras biológicas, que pueden limitar o prevenir la eficacia de Ab en aerosol. Actualmente, los acontecimientos que ocurren después de que el Ab inhalado se haya depositado en las vías respiratorias no se conocen del todo y requieren una caracterización más profunda.

Las bronquiectasias por fibrosis no quística (NCFB) son un grupo de enfermedades crónicas supurativas de las vías respiratorias de múltiples etiologías. Clínicamente, el NFCB se caracteriza por una dilatación anormal e irreversible de los bronquios, obstrucción de las vías respiratorias, tos crónica y aumento de la producción de esputo. A nivel fisiopatológico, la inflamación crónica, la colonización bacteriana crónica de las vías respiratorias y el aumento de la producción de moco en las vías respiratorias desempeñan papeles clave. El tratamiento actual para la colonización microbiana y/o las exacerbaciones agudas del NFCB se basa principalmente en dosis altas de antibióticos sistémicos o administrados por las vías respiratorias. La azitromicina en dosis bajas a largo plazo también se usa a menudo para reducir la inflamación de las vías respiratorias, los síntomas y la frecuencia de las exacerbaciones agudas. Dado que los antibióticos pueden no mejorar los síntomas o generar resistencia microbiana, se necesitan nuevos tratamientos para mejorar la eliminación de patógenos y reducir la inflamación de las vías respiratorias.

La inmunoglobulina G policlonal (IgG) inhalada es un nuevo enfoque terapéutico para el NCFB. Se espera que la IgG inhalada medie efectos beneficiosos en NCFB debido a su capacidad para reducir la variedad de patógenos respiratorios capaces de infectar el tracto respiratorio, disminuir la carga pulmonar de las poblaciones bacterianas existentes, mejorar la eliminación mucociliar al restaurar las funciones de las células epiteliales y disminuir la inflamación pulmonar. . De hecho, los paquetes de datos preclínicos mostraron una carga reducida de patógenos y daño celular relacionado después de la infección en roedores y primates no humanos. Actualmente se están llevando a cabo un ensayo de fase 1 en pacientes con NCFB y un estudio de toxicología crónica para permitir un ensayo de fase 2, que incluye la administración diaria y profiláctica de IgG nebulizada durante 6 meses en pacientes con NCFB (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

En NCFB, el moco de las vías respiratorias puede actuar como una barrera para los fármacos inhalados en la interfaz mucosa. Mientras que el moco normal se presenta como una capa delgada que permite que la IgG se difunda eficientemente a los tejidos subyacentes, el moco de las vías respiratorias en NCFB está presente en cantidades mayores y es anormalmente espeso. Por tanto, la alteración de la cantidad, estructura y fluidez del moco durante las bronquiectasias puede limitar la penetración de los Ab inhalados y su potencial terapéutico. Los pacientes con NCFB también presentan con frecuencia colonización bacteriana crónica de las vías respiratorias e inflamación crónica de las vías respiratorias caracterizada por una mayor actividad de la proteasa. También suelen sufrir exacerbaciones, que son episodios de aumento de los síntomas provocados por patógenos (en particular, P. aeruginosa y el virus de la influenza) que requieren intervención médica, que a menudo incluye la administración de antibióticos. En el contexto de una inflamación excesiva, la cantidad de proteasas supera la capacidad neutralizante de los inhibidores de proteasa endógenos. Esto puede tener un impacto dramático en el metabolismo de los Ab inhalados y limitar su eficacia. De hecho, informes anteriores muestran que la proteólisis de IgG mediada por elastasa derivada de neutrófilos conduce a una disminución de anti-P. aeruginosa fagocitosis y muerte. Además de las enzimas endógenas (principalmente proteasas de serina [derivadas de neutrófilos] y cisteína [catepsina]), los patógenos bacterianos, como P. aeruginosa, también secretan proteasas, que pueden degradar los fármacos administrados por vía respiratoria. Además, patógenos como P. aeruginosa inducen la expresión de mucina.

Durante un primer estudio in vitro, evaluamos el efecto barrera del moco artificial con una viscosidad en el rango de la medida en el moco derivado del esputo de pacientes con enfermedades respiratorias. CEPR observó una alteración significativa de la movilidad y difusión de la IgG policlonal (CSL Behring) añadida exógenamente, dependiente de la viscosidad del ASM. Es importante destacar que CEPR también determinó una reducción significativa en la capacidad de la IgG policlonal para unirse a P. aeruginosa en presencia de moco viscoso en comparación con el moco fluido.

Objetivos del estudio. El objetivo principal es evaluar el impacto del moco derivado del esputo de pacientes con NCFB sobre la unión de una IgG policlonal a Pseudomonas aeruginosa. Los resultados obtenidos con el moco del paciente NCFB se compararán con los resultados obtenidos utilizando moco artificial. Los objetivos secundarios son la caracterización de 1) movilidad de IgG policlonal exógena y 2) estabilidad en el moco derivado del esputo de pacientes con NCFB. Además, se explorará el impacto de la colonización microbiana de las vías respiratorias en la farmacodinamia de la IgG.

Diseño del estudio. Este es un estudio exploratorio, prospectivo, monocéntrico, transversal, intervencionista con riesgos y limitaciones mínimos de pacientes con bronquiectasias por fibrosis no quística (NCFB) seguido por el centro de enfermedades pulmonares raras y el departamento de Neumología del Hospital Universitario de Tours (CHRU Tours). Los pacientes incluidos en el estudio continuarán con su seguimiento habitual. El manejo médico habitual -diagnóstico y/o terapéutico- no se verá modificado por la participación en el estudio, salvo un estudio microbiológico adicional del esputo como parte del estudio.

Este estudio se centrará en el análisis de las propiedades bioquímicas y biofísicas de una preparación terapéutica de IgG policlonal en presencia de esputo aislado de pacientes con NCFB, y más específicamente en la capacidad de la IgG para reconocer un objetivo. También se evaluará la movilidad y estabilidad de la IgG en el moco de las vías respiratorias. Para asociar los criterios de valoración de la EP, medidos en el CEPR, con parámetros clínicamente relevantes, la recogida de esputo irá acompañada de documentación, en moco y sangre, de análisis microbiológicos (análisis virológicos y bacteriológicos) e inflamatorios (formulación sanguínea, proteína C reactiva). parámetros - medidos en el CHRU de Tours.

Los análisis en el compartimento sanguíneo se realizarán utilizando un volumen adicional de sangre extraído en el momento de la visita, respetando los límites y contraindicaciones (de conformidad con la orden del 4 de abril de 2018 del artículo L.1121-1 de la Ley de Salud Pública). código). El análisis de las vías respiratorias se realizará a partir del esputo recogido de los pacientes. Se planificará un único punto de análisis para cada paciente incluido en el estudio.

Medidas de resultado. El resultado principal es la cuantificación de la unión de IgG policlonal a Pseudomonas aeruginosa en presencia de moco derivado del esputo de pacientes con NCFB. La unión se evaluará mediante ELISA de células completas.

Los resultados se expresarán como porcentaje de unión sobre el obtenido cuando se agrega la IgG policlonal en solución salina y se compararán con preparaciones de mocos artificiales en un rango de viscosidad similar al moco de las vías respiratorias humanas.

Los resultados secundarios son: (1) la medición de la proteólisis, mediante Western-Blot, de IgG policlonal exógena agregada en el moco derivado del esputo de pacientes con NCFB. Los resultados se expresarán como porcentaje de integridad sobre el obtenido al agregar la IgG policlonal en solución salina y se compararán con resultados in vitro; (2) la medición de la movilidad mediante FRAP de IgG policlonal exógena marcada con fluorescencia agregada en el moco derivado del esputo de pacientes con NCFB. Los resultados incluirán la determinación de las fracciones t(1/2), móvil e inmóvil sobre la obtenida cuando se agrega la IgG policlonal en solución salina y se compararán con resultados in vitro. Esto se hará en el CEPR. (3) impacto de la colonización microbiana de las vías respiratorias sobre la unión de IgG, la proteólisis y la movilidad de Ig. Las muestras con colonización microbiana (ya sea bacteriana, viral o fúngica) se compararán con muestras no colonizadas.

Selección y reclutamiento de personas idóneas para la investigación. La población del estudio incluye a todos los pacientes con una edad ≥ 18 años que padecen NCFB y seguidos por el centro de enfermedades pulmonares raras/departamento de Neumología de CHRU Tours (la lista activa comprende 181 pacientes con NCFB idiopático en septiembre de 2023). Estos pacientes asisten habitualmente a visitas clínicas que incluyen espirometría forzada al menos una vez al año. En este estudio transversal, los pacientes serán evaluados según los registros médicos del Centro de Enfermedades Pulmonares Raras del hospital universitario de Tours (CHRU Bretonneau). En particular, se examinará a los pacientes para detectar la producción crónica de esputo. Se estima que un tercio de todos los pacientes pueden ser elegibles para el estudio. A los pacientes elegibles se les ofrecerá participar en el momento de una visita programada al hospital o mediante una llamada telefónica de un asistente de investigación o una enfermera de investigación. A los pacientes interesados ​​en el estudio se les proporcionará el documento informativo para obtener más información. Cuando los pacientes den su consentimiento oral para participar en el estudio, se les invitará a visitar el Centro de Investigación Clínica (CIC Inserm 1415) del hospital. Luego, los pacientes se reunirán con un investigador. Para participar, un sujeto debe cumplir con todos los criterios de inclusión y ningún criterio de no inclusión. El consentimiento será confirmado por el investigador después de una reunión con el sujeto y revisión de la carta de consentimiento.

Visita de estudio. En el momento de la inclusión, el paciente asistirá a la visita de un investigador para registrar el examen clínico y los signos vitales, fecha de la última exacerbación aguda, historial médico, tratamiento y cuestionario respiratorio de Saint George (medida de calidad de vida). La descripción de las bronquiectasias a partir de la última tomografía computarizada (TC), la gravedad del deterioro de la función pulmonar definida por la última espirometría (FEV1) y el índice de gravedad de las bronquiectasias serán validados por un neumólogo experimentado.

Recopilación de datos clínicos.

En el momento de la inclusión, el paciente asistirá a la visita de un investigador para registrar:

• historial medico
• Tratamiento actual
• Examen clínico y signos vitales (presión arterial, frecuencia cardíaca, saturación percutánea de hemoglobina-SPO2 mientras se respira aire ambiente)
• escala de disnea mMRC
• Descripción de la gravedad de las bronquiectasias a partir de la última TC, utilizando la puntuación de TC radiológicamente indexada (BRICS) y el número de lóbulos afectados 19
• Gravedad del deterioro del flujo de aire (espiración forzada en 1 segundo-FEV1) de la última espirometría. El FEV1 se expresa como porcentaje del valor previsto utilizando las ecuaciones de referencia GLI2012.
• Fecha de la última exacerbación aguda (definida como aumento de los síntomas respiratorios que duran >48 h y nueva prescripción de antibióticos)
• Número y fecha de exacerbaciones graves que requirieron hospitalización
• Número de exacerbaciones agudas que requirieron terapia con antibióticos en el último año
• Cuestionario respiratorio de Saint George (medida de calidad de vida)
• Historia de colonización de las vías respiratorias por Pseudomonas u otras bacterias.

Recogida de muestras de sangre y esputo inhalado. Después de la consulta médica, una enfermera del CIC extraerá 3 x 5 ml de sangre venosa para análisis hematológicos y bioquímicos. Se utilizará 1 tubo para análisis inmunológicos realizados en el CEPR.

Después de la extracción de sangre, los sujetos recibirán un aerosol de NaCl al 0,9% si la SPO2 mientras respiran aire ambiente es ≥94%, y se recolectarán muestras de esputo inducido. Los pasos clave de la administración de aerosoles y la recolección de esputo son:

• El paciente se enjuaga la boca con agua potable (para reducir la contaminación de la muestra con saliva)
• El paciente se suena la nariz (para reducir la contaminación de la muestra con moco de las vías respiratorias superiores)
• Comience la nebulización de 15 ml de NaCl al 0,9 % administrados mediante un nebulizador neumático (6 l/min de aire)
• Durante e inmediatamente después del aerosol de NaCl, se anima al sujeto a expectorar en un tubo de muestreo de 50 ml al menos 3 veces (5, 10, 15 minutos).

Análisis de muestras. Inmediatamente después de la recolección, la muestra de esputo se enviará a los departamentos de Bacteriología, Virología y Micología de CHRU Tours para la caracterización de poblaciones microbianas (tinción de Gram y cultivos bacterianos, tinción de Gomori-Grocott y cultivos de hongos, RTPCR múltiple para patógenos respiratorios). Luego, la muestra de esputo restante se enviará al CEPR para análisis farmacológicos de la preparación de IgG. Las muestras no utilizadas o sobrantes se conservarán en el CEPR en una colección específica para futuras experimentaciones. Se conservarán durante un período de tiempo ilimitado.

Se enviarán muestras de sangre a los laboratorios de Hematología y Bioquímica para recuentos de células sanguíneas y ensayos de proteína C reactiva. Se utilizará 1 tubo para análisis inmunológicos (fenotipado de neutrófilos, medición de IgG total) realizados en el CEPR.

No está programado ningún seguimiento del sujeto como parte del estudio.