Rolle von Barrieren bei IgG-Pathogen-Interaktionen an der Schleimhautoberfläche menschlicher Atemwege (BARRIG)

Seit dem Aufkommen der monoklonalen Antikörpertechnologie haben sich therapeutische Antikörper (Ab) bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten als erfolgreich erwiesen. Ab hat die Behandlung tödlicher Krankheiten, vom Non-Hodgkin-Lymphom bis hin zu Asthma-Subtypen, radikal verändert. Der Erfolg von Ab basiert auf ihrer hohen Selektivität, vorhersehbaren Toxizität und einzigartigen pharmakologischen Profilen, die ihnen Vorteile gegenüber niedermolekularen Arzneimitteln verschaffen. Damit stellt Ab die am schnellsten wachsende Klasse von Biotherapeutika dar, wobei fünf davon zu den meistverkauften Medikamenten in den USA gehören.

Millionen Menschen weltweit sind von Atemwegserkrankungen betroffen; Die vier am häufigsten tödlichen Lungenerkrankungen (Pneumonie, Tuberkulose, Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankung [COPD]) sind laut WHO im Jahr 2030 für etwa jeden fünften Todesfall weltweit verantwortlich. Zusätzlich zur vorzeitigen Sterblichkeit haben Atemwegserkrankungen dramatische Auswirkungen auf die Gesellschaft im Hinblick auf Behinderungen, Gesundheitskosten und Produktivitätsverluste, was die Notwendigkeit neuer Therapeutika drängt. Mit über 100 Molekülen in der klinischen Prüfung und einem Dutzend Antikörpern (Ab), die die Marktzulassung erhalten haben, besteht für Ab eine enorme Chance, Patienten mit Atemwegserkrankungen, einschließlich Bronchiektasen, zu helfen. Gegenwärtig werden Ab als alternative oder ergänzende Strategien zu Antitumor-, entzündungshemmenden und antiinfektiösen Wirkstoffen, insbesondere zu Antibiotika, indiziert. Das Verhalten von Ab hängt von ihrer Pharmakodynamik (PD) und Pharmakokinetik (PK) ab, die teilweise von ihrem Verabreichungsweg abhängt. Bisher werden Antikörper gegen Atemwegserkrankungen hauptsächlich intravenös oder subkutan verabreicht, was nicht optimal ist, um eine therapeutische Konzentration des Wirkstoffs in der Lunge sicherzustellen, während andere Organe dem Medikament ausgesetzt werden.

Bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen ermöglicht die Inhalation eine gezielte Einwirkung auf die Atemwege. Ziel der Inhalation ist die topische Abgabe von Arzneimitteln – als Aerosol – durch die Nase und/oder den Mund an den Wirkungsort. Die Inhalation ist der Goldstandard für die Verabreichung von Arzneimitteln mit topischer Wirkung zur Behandlung von Asthma oder COPD. Die Inhalation bietet für einige Medikamente einen besseren therapeutischen Index, erfordert im Vergleich zu anderen Verabreichungswegen oft eine geringere Dosis und ist nichtinvasiv, wodurch die Therapietreue und der Patientenkomfort verbessert werden. Derzeit handelt es sich bei den meisten (topischen) Inhalationsmedikamenten um kleine Moleküle aus verschiedenen Klassen. Bei Ab handelt es sich in der Regel um IgG voller Länge, bei denen es sich um große heterodimere Proteine ​​(~150 kDa) handelt, die nicht passiv über zelluläre Barrieren diffundieren. Derzeit wird der Großteil der Antikörper gegen Atemwegserkrankungen intravenös (i.v.) verabreicht. Die i.v. Der Weg ist für Ab im Zusammenhang mit Atemwegserkrankungen möglicherweise nicht optimal, da nach i.v. nur ein kleiner Teil der Ab die Lunge/Atemwege erreicht. Injektion. Die Inhalation ist ein attraktiver und praktikabler alternativer Weg für die topische Verabreichung von Ab in voller Länge in die Lunge. Über die Atemwege abgegebene Antikörper zeigen therapeutische Reaktionen und werden größtenteils mit geringer systemischer Diffusion in der Lunge zurückgehalten. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Inhalation möglicherweise einen Vorteil gegenüber anderen Verabreichungswegen hat, wenn Antikörper in den Atemwegen wirken sollen.

Trotz der theoretischen Vorteile der topischen Verabreichung von Ab durch Inhalation haben sich in den Kliniken bisher nur wenige dieser Vorteile gezeigt. Derzeit befinden sich mehrere Antikörper zur Inhalation in der klinischen Entwicklung, aber noch keiner befindet sich in der Klinik. Dieser Mangel verdeutlicht die Komplexität der Entwicklung inhalierter Antikörper und weist auf die weiterhin zu überwindenden Hürden hin. Um den erfolgreichen Übergang von der präklinischen zur klinischen Entwicklung sicherzustellen, ist ein detailliertes Verständnis der Pharmakologie inhalierter Antikörper erforderlich. Insbesondere die Ablagerung von Ab-Aerosolen bei Atemwegserkrankungen kann durch biologische Barrieren moduliert werden, die die Wirksamkeit von aerosolisierten Ab einschränken oder verhindern können. Derzeit sind die Ereignisse, die nach der Ablagerung von inhaliertem Antikörper in den Atemwegen auftreten, unvollständig bekannt und erfordern eine eingehendere Charakterisierung.

Nicht-zystische Fibrose-Bronchiektasien (NCFB) sind eine Gruppe eitriger chronischer Atemwegserkrankungen unterschiedlicher Genese. Klinisch ist NFCB durch eine abnormale, irreversible Erweiterung der Bronchien, eine Obstruktion der Atemwege, chronischen Husten und eine erhöhte Sputumproduktion gekennzeichnet. Auf pathophysiologischer Ebene spielen chronische Entzündungen, eine chronische Besiedlung der Atemwege mit Bakterien und eine erhöhte Schleimproduktion in den Atemwegen eine Schlüsselrolle. Die derzeitige Behandlung der mikrobiellen Besiedlung und/oder akuten Exazerbationen von NFCB beruht meist auf hochdosierten systemischen oder über die Atemwege verabreichten Antibiotika. Niedrig dosiertes Langzeit-Azithromycin wird außerdem häufig eingesetzt, um Atemwegsentzündungen, Symptome und die Häufigkeit akuter Exazerbationen zu reduzieren. Da Antibiotika entweder keine Linderung der Symptome bewirken oder keine mikrobielle Resistenz fördern, besteht ein Bedarf an neuen Behandlungen, um die Beseitigung von Krankheitserregern zu verbessern und Entzündungen der Atemwege zu reduzieren.

Inhaliertes polyklonales Immunglobulin G (IgG) ist ein neuer Therapieansatz für NCFB. Es wird erwartet, dass inhaliertes IgG positive Wirkungen bei NCFB vermittelt, da es das Spektrum der Atemwegserreger, die die Atemwege infizieren können, reduzieren, die Lungenlast vorhandener Bakterienpopulationen verringern, die mukoziliäre Clearance durch Wiederherstellung der Epithelzellfunktionen verbessern und Lungenentzündungen verringern kann . Tatsächlich zeigten präklinische Datenpakete eine verringerte Krankheitserregerlast und damit verbundene Zellschäden nach der Infektion bei Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten. Derzeit laufen eine Phase-1-Studie bei NCFB-Patienten und eine chronische Toxikologiestudie zur Ermöglichung einer Phase-2-Studie, einschließlich der täglichen und prophylaktischen Verabreichung von vernebeltem IgG über 6 Monate bei NCFB-Patienten (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

Bei NCFB kann Atemwegsschleim an der Schleimhautschnittstelle als Barriere für inhalierte Medikamente wirken. Während normaler Schleim eine dünne Schicht darstellt, die es IgG ermöglicht, effizient in das darunter liegende Gewebe zu diffundieren, ist Atemwegsschleim bei NCFB in erhöhten Mengen vorhanden und ungewöhnlich dick. Eine Beeinträchtigung der Menge, Struktur und Fließfähigkeit des Schleims während der Bronchiektasie kann daher die Penetration inhalierter Ab und deren therapeutisches Potenzial einschränken. Patienten mit NCFB leiden außerdem häufig an einer chronischen bakteriellen Besiedlung der Atemwege und einer chronischen Atemwegsentzündung, die durch eine erhöhte Proteaseaktivität gekennzeichnet ist. Sie leiden auch häufig unter Exazerbationen, bei denen es sich um durch Krankheitserreger (insbesondere P. aeruginosa und Influenzaviren) verursachte Episoden verstärkter Symptome handelt, die einen medizinischen Eingriff, häufig einschließlich der Verabreichung von Antibiotika, erfordern. Im Zusammenhang mit einer übermäßigen Entzündung übersteigt die Menge an Proteasen die Neutralisierungskapazität endogener Proteaseinhibitoren. Dies kann dramatische Auswirkungen auf den inhalierten Ab-Stoffwechsel haben und deren Wirksamkeit einschränken. Tatsächlich zeigen frühere Berichte, dass die durch von Neutrophilen abgeleitete Elastase vermittelte IgG-Proteolyse zu einer Abnahme von Anti-P führt. Aeruginosa-Phagozytose und Abtötung. Zusätzlich zu endogenen Enzymen (hauptsächlich Serin-Proteasen [von Neutrophilen abgeleitet] und Cystein-Proteasen [Cathepsin]) sezernieren bakterielle Krankheitserreger wie P. aeruginosa auch Proteasen, die über die Atemwege verabreichte Arzneimittel abbauen können. Darüber hinaus induzieren Krankheitserreger wie P. aeruginosa die Mucin-Expression.

In einer ersten In-vitro-Studie haben wir die Barrierewirkung von künstlichem Schleim untersucht, dessen Viskosität im Bereich derjenigen liegt, die in Schleim aus Sputum von Patienten mit Atemwegserkrankungen gemessen wird. CEPR beobachtete eine signifikante Veränderung der Mobilität und Diffusion des exogen zugesetzten polyklonalen IgG (CSL Behring), abhängig von der Viskosität des ASM. Wichtig ist, dass CEPR auch eine signifikante Verringerung der Fähigkeit des polyklonalen IgG zur Bindung an P. aeruginosa in Gegenwart von viskosem Schleim im Vergleich zu flüssigem Schleim feststellte.

Studienziele. Das Hauptziel besteht darin, den Einfluss von Schleim aus dem Sputum von NCFB-Patienten auf die Bindung eines polyklonalen IgG an Pseudomonas aeruginosa zu bewerten. Die mit NCFB-Patientenschleim erzielten Ergebnisse werden mit Ergebnissen verglichen, die mit künstlichem Schleim erzielt wurden. Sekundäre Ziele sind die Charakterisierung 1) der exogenen polyklonalen IgG-Mobilität und 2) der Stabilität im Schleim aus dem Sputum von NCFB-Patienten. Darüber hinaus wird der Einfluss der mikrobiellen Besiedlung der Atemwege auf die Pharmakodynamik von IgG untersucht.

Studiendesign. Hierbei handelt es sich um eine explorative, prospektive, monozentrische, interventionelle Querschnittsstudie mit minimalen Risiken und Einschränkungen an Patienten mit nicht-zystischer Fibrose-Bronchiektasie (NCFB), gefolgt vom Zentrum für seltene Lungenerkrankungen und der Abteilung für Pneumologie des Universitätsklinikums Tours (CHRU Tours). Die in die Studie einbezogenen Patienten werden weiterhin wie gewohnt nachuntersucht. Das übliche medizinische Management – ​​diagnostisch und/oder therapeutisch – wird durch die Teilnahme an der Studie nicht verändert, abgesehen von einer zusätzlichen mikrobiologischen Untersuchung des Sputums im Rahmen der Studie.

Diese Studie konzentriert sich auf die Analyse der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften eines therapeutischen polyklonalen IgG-Präparats in Gegenwart von Sputum, das von NCFB-Patienten isoliert wurde, und insbesondere auf die Fähigkeit von IgG, ein Ziel zu erkennen. Mobilität und Stabilität von IgG im Atemwegsschleim werden ebenfalls bewertet. Um PD-Endpunkte – gemessen am CEPR – mit klinisch relevanten Parametern zu verknüpfen, wird die Sputumentnahme von der Dokumentation mikrobiologischer (virologischer und bakteriologischer Analysen) und entzündlicher (Blutformulierung, C-reaktives Protein) in Schleim und Blut begleitet. Parameter - gemessen am CHRU von Tours.

Analysen im Blutkompartiment werden mit einer zusätzlichen Blutmenge durchgeführt, die zum Zeitpunkt des Besuchs entnommen wird, unter Berücksichtigung der Grenzwerte und Kontraindikationen (gemäß der Verordnung vom 4. April 2018, Artikel L.1121-1 des Gesundheitsministeriums). Code). Die Analyse in den Atemwegen wird anhand von Patientensputum durchgeführt. Für jeden in die Studie einbezogenen Patienten wird ein einzelner Analysepunkt geplant.

Ergebnismaße. Das Hauptergebnis ist die Quantifizierung der polyklonalen IgG-Bindung an Pseudomonas aeruginosa in Gegenwart von Schleim aus dem Sputum von NCFB-Patienten. Die Bindung wird durch Ganzzell-ELISA beurteilt.

Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Bindung im Vergleich zu der Bindung ausgedrückt, die bei Zugabe des polyklonalen IgG in Kochsalzlösung erhalten wird, und werden mit künstlichen Schleimpräparaten in einem Viskositätsbereich verglichen, der dem menschlichen Atemwegsschleim ähnelt.

Sekundäre Ergebnisse sind: (1) die Messung der Proteolyse durch Western-Blot von exogenem polyklonalem IgG, das dem aus dem Sputum von NCFB-Patienten stammenden Schleim zugesetzt wird. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Integrität gegenüber dem Ergebnis ausgedrückt, das bei Zugabe des polyklonalen IgG in Kochsalzlösung erzielt wird, und mit In-vitro-Ergebnissen verglichen. (2) die Messung der Mobilität durch FRAP von exogenem fluoreszierend markiertem polyklonalem IgG, das dem aus dem Sputum von NCFB-Patienten stammenden Schleim zugesetzt wurde. Zu den Ergebnissen gehört die Bestimmung der t(1/2) sowie der mobilen und immobilen Fraktionen im Vergleich zu denen, die bei Zugabe des polyklonalen IgG in Kochsalzlösung erhalten werden, und werden mit In-vitro-Ergebnissen verglichen. Dies wird beim CEPR erfolgen. (3) Einfluss der mikrobiellen Besiedlung der Atemwege auf die IgG-Bindung, Proteolyse und Ig-Mobilität. Proben mit mikrobieller Besiedlung (entweder Bakterien, Viren oder Pilze) werden mit unbesiedelten Proben verglichen.

Auswahl und Rekrutierung von für die Forschung geeigneten Personen. Die Studienpopulation umfasst alle Patienten mit einem Alter von ≥ 18 Jahren, die an NCFB leiden, gefolgt vom Zentrum für seltene Lungenerkrankungen/Pneumologieabteilung von CHRU Tours (die aktive Liste umfasst 181 Patienten mit idiopathischem NFCB im September 2023). Diese Patienten nehmen regelmäßig mindestens einmal jährlich an Klinikbesuchen teil, einschließlich einer Zwangsspirometrie. In dieser Querschnittsstudie werden Patienten auf der Grundlage medizinischer Unterlagen des Rares Pulmonary Diseases Centre am Universitätskrankenhaus Tours (CHRU Bretonneau) untersucht. Insbesondere werden die Patienten auf chronische Sputumproduktion untersucht. Es wird geschätzt, dass ein Drittel aller Patienten für die Studie geeignet sein könnte. Berechtigten Patienten wird die Teilnahme entweder zum Zeitpunkt eines geplanten Besuchs im Krankenhaus oder durch einen Anruf eines wissenschaftlichen Mitarbeiters oder einer wissenschaftlichen Krankenschwester angeboten. Patienten, die an der Studie interessiert sind, erhalten zur weiteren Information das Informationsdokument. Wenn Patienten mündlich ihre Einwilligung zur Teilnahme an der Studie geben, werden sie zu einem Besuch im Clinical Investigation Center (CIC Inserm 1415) des Krankenhauses eingeladen. Die Patienten treffen dann einen Prüfer. Um beteiligt zu werden, muss ein Proband alle Einschlusskriterien und keine Nichteinschlusskriterien erfüllen. Die Einwilligung wird vom Prüfer nach einem Treffen mit dem Probanden und Prüfung des Einverständnisschreibens bestätigt.

Studienaufenthalt. Bei der Aufnahme nimmt der Patient an einem Besuch eines Prüfarztes teil, um die klinische Untersuchung und die Vitalfunktionen, das Datum der letzten akuten Exazerbation, die Krankengeschichte, die Behandlung und den Saint-Georgs-Atemfragebogen (Messung der Lebensqualität) aufzuzeichnen. Die Beschreibung der Bronchiektasie aus dem letzten Computertomographie-Scan (CT), der Schweregrad der Lungenfunktionsbeeinträchtigung, definiert durch die neueste Spirometrie (FEV1), und der Schweregradindex der Bronchiektasie werden von einem leitenden Lungenarzt validiert.

Klinische Datenerfassung.

Bei der Aufnahme nimmt der Patient an einem Besuch eines Prüfarztes teil, um Folgendes aufzuzeichnen:

• Krankengeschichte
• Aktuelle Behandlung
• Klinische Untersuchung und Vitalparameter (Blutdruck, Herzfrequenz, perkutane Hämoglobinsättigung-SPO2 beim Atmen der Raumluft)
• mMRC-Dyspnoe-Skala
• Beschreibung des Schweregrads der Bronchiektasie aus der letzten CT unter Verwendung des Bronchiectasis Radiological Indexed CT Score (BRICS) und der Anzahl der betroffenen Lappen 19
• Schweregrad der Atemwegsbeeinträchtigung (erzwungene Ausatmung in 1 Sekunde – FEV1) gemäß der letzten Spirometrie. FEV1 wird als Prozentsatz des vorhergesagten Werts unter Verwendung der GLI2012-Referenzgleichungen ausgedrückt
• Datum der letzten akuten Exazerbation (definiert als verstärkte Atemwegsbeschwerden über mehr als 48 Stunden und eine neue Antibiotikaverordnung)
• Anzahl und Datum schwerer Exazerbationen, die einen Krankenhausaufenthalt erforderlich machten
• Anzahl der akuten Exazerbationen, die im vergangenen Jahr eine Antibiotikatherapie erforderten
• Atemwegsfragebogen nach St. George (Messung der Lebensqualität)
• Vorgeschichte einer Besiedlung der Atemwege durch Pseudomonas oder andere Bakterien

Entnahme von Blut- und inhalierten Sputumproben. Nach der ärztlichen Konsultation werden von einer CIC-Krankenschwester 3 x 5 ml venöses Blut für hämatologische und biochemische Analysen entnommen. 1 Röhrchen wird für die am CEPR durchgeführte immunologische Analyse verwendet.

Nach der Blutentnahme erhalten die Probanden ein 0,9 %iges NaCl-Aerosol, wenn der SPO2 beim Atmen der Raumluft ≥94 % beträgt, und es werden induzierte Sputumproben entnommen. Die wichtigsten Schritte der Aerosolabgabe und Sputumsammlung sind:

• Der Patient spült seinen Mund mit Trinkwasser (um eine Kontamination der Probe mit Speichel zu reduzieren)
• Der Patient putzt sich die Nase (um eine Kontamination der Probe mit Schleim der oberen Atemwege zu reduzieren)
• Beginnen Sie mit der Vernebelung von 15 ml 0,9 % NaCl, verabreicht über einen pneumatischen Vernebler (6 l/min Luft).
• Während und unmittelbar nach der NaCl-Aerosolgabe wird der Proband aufgefordert, mindestens dreimal (5, 10, 15 Minuten) in ein 50-ml-Probenahmeröhrchen auszuhusten.

Probenanalyse. Unmittelbar nach der Entnahme wird die Sputumprobe zur Charakterisierung mikrobieller Populationen (Gram-Färbung und Bakterienkulturen, Gomori-Grocott-Färbung und Pilzkulturen, Multiplex-RTPCR für Atemwegspathogene) an die Abteilungen für Bakteriologie, Virologie und Mykologie von CHRU Tours geschickt. Die verbleibende Sputumprobe wird dann zur pharmakologischen Analyse des IgG-Präparats an CEPR geschickt. Nicht verwendete oder übrig gebliebene Proben werden am CEPR in einer speziellen Sammlung für weitere Experimente aufbewahrt. Sie werden unbeschränkt aufbewahrt.

Blutproben werden zur Blutzellzählung und zur Bestimmung des C-reaktiven Proteins an die Hämatologie- und Biochemielabore geschickt. 1 Röhrchen wird für die am CEPR durchgeführte immunologische Analyse (Neutrophile-Phänotypisierung, Gesamt-IgG-Messung) verwendet.

Im Rahmen der Studie ist keine Nachuntersuchung des Probanden geplant.