Роль БАРЬЕРОВ во взаимодействиях IgG с патогенами на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей человека (BARRIG)

С момента появления технологии моноклональных антител терапевтические антитела (Ab) доказали свою эффективность в лечении различных заболеваний. Аб радикально изменил методы лечения и лечения смертельных заболеваний, от неходжкинской лимфомы до подтипов астмы. Успех АТ основан на их высокой селективности, предсказуемой токсичности и уникальных фармакологических профилях, что дает им преимущества перед низкомолекулярными лекарствами. В результате Ab представляет собой наиболее быстрорастущий класс биотерапевтических препаратов, причем пять из них входят в число самых продаваемых препаратов в США.

Респираторные заболевания поражают миллионы людей во всем мире; По данным ВОЗ, на четыре наиболее часто смертельных заболевания легких (пневмония, туберкулез, рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких [ХОБЛ]) будет приходиться примерно одна из пяти смертей в мире в 2030 году. Помимо преждевременной смертности, респираторные заболевания оказывают огромное влияние на общество в плане инвалидности, затрат на здравоохранение и снижения производительности, что требует новых методов лечения. Имея более 100 молекул, находящихся на стадии клинической оценки, и дюжину антител (Ab), получивших одобрение на продажу, Ab имеют огромную возможность принести пользу пациентам с респираторными заболеваниями, включая бронхоэктазы. В настоящее время антитела показаны в качестве альтернативы или дополнения к противоопухолевым, противовоспалительным и противоинфекционным средствам, в частности к антибиотикам. Поведение Ab зависит от их фармакодинамики (ФД) и фармакокинетики (ФК), которые частично зависят от пути их введения. До сих пор АТ при заболеваниях органов дыхания в основном вводят внутривенно или подкожно, что не является оптимальным для обеспечения терапевтической концентрации активного препарата в легких при воздействии препарата на другие органы.

Для лечения респираторных заболеваний ингаляции позволяют воздействовать непосредственно на дыхательные пути. Целью ингаляции является местная доставка лекарственного средства в виде аэрозоля через нос и/или рот к месту его действия. Ингаляция является золотым стандартом доставки препаратов местного действия для лечения астмы или ХОБЛ. Ингаляция обеспечивает лучший терапевтический индекс для некоторых препаратов, часто требует снижения дозы по сравнению с другими способами и является неинвазивным, что повышает приверженность лечению и комфорт пациента. В настоящее время большинство ингаляционных препаратов (местного применения) представляют собой небольшие молекулы разных классов. Ab обычно представляют собой полноразмерные IgG, которые представляют собой крупные гетеродимерные белки (~ 150 кДа), которые не диффундируют пассивно через клеточные барьеры. В настоящее время большая часть АБ для лечения респираторных заболеваний вводится внутривенным путем (в/в). Внутривенное введение Путь введения антител может быть неоптимальным в контексте респираторных заболеваний, поскольку только небольшая часть антител достигает легких/дыхательных путей после внутривенного введения. инъекция. Ингаляция является привлекательным и осуществимым альтернативным путем местной доставки полноразмерных антител в легкие. Аб, доставленные через дыхательные пути, демонстрируют терапевтический ответ и в основном сохраняются в легких с низкой системной диффузией. В целом, эти результаты указывают на то, что ингаляционное введение может иметь преимущество перед другими путями введения, когда антитела предназначены для действия в дыхательных путях.

Несмотря на теоретические преимущества местного применения АТ путем ингаляций, лишь немногие из этих преимуществ пока реализованы в клиниках. В настоящее время несколько антител находятся в клинической разработке для ингаляционного введения, но ни одно из них еще не поступило в клиники. Этот дефицит подчеркивает сложность разработки ингаляционных антител и указывает на сохраняющиеся препятствия, которые необходимо преодолеть. Детальное понимание фармакологии ингаляционных антител необходимо для обеспечения успешного перехода от доклинической разработки к клинической. В частности, отложение аэрозоля Ab во время респираторных заболеваний может модулироваться биологическими барьерами, которые могут ограничивать или предотвращать эффективность аэрозольных Ab. В настоящее время события, которые происходят после того, как вдыхаемые антитела отложились в дыхательных путях, не полностью известны и требуют более глубокой характеристики.

Немуковисцидозные бронхоэктатические болезни (БНКФБ) — группа гнойных хронических заболеваний дыхательных путей множественной этиологии. Клинически НФКБ характеризуется аномальным необратимым расширением бронхов, обструкцией дыхательных путей, хроническим кашлем и повышенным выделением мокроты. На патофизиологическом уровне ключевую роль играют хроническое воспаление, хроническая бактериальная колонизация дыхательных путей и повышенная выработка слизи в дыхательных путях. Современное лечение микробной колонизации и/или обострений НЦБ в основном основано на применении высоких доз системных антибиотиков или антибиотиков, вводимых через дыхательные пути. Также применяют низкие дозы азитромицина длительного действия, часто используемые для уменьшения воспаления дыхательных путей, симптомов и частоты острых обострений. Поскольку антибиотики могут либо не облегчить симптомы, либо вызвать резистентность микроорганизмов, существует необходимость в новых методах лечения, позволяющих улучшить выведение патогенов и уменьшить воспаление дыхательных путей.

Ингаляционный поликлональный иммуноглобулин G (IgG) является новым терапевтическим подходом к NCFB. Ожидается, что ингаляционные IgG будут опосредовать благоприятные эффекты при NCFB благодаря своей способности уменьшать спектр респираторных патогенов, способных инфицировать дыхательные пути, уменьшать легочную нагрузку существующих бактериальных популяций, улучшать мукоцилиарный клиренс за счет восстановления функций эпителиальных клеток и уменьшать воспаление легких. . Действительно, пакеты доклинических данных показали снижение нагрузки патогенов и связанного с ними повреждения клеток после заражения у грызунов и приматов, кроме человека. В настоящее время проводятся исследование фазы 1 на пациентах с NCFB и исследование хронической токсикологии, позволяющее провести исследование фазы 2, включающее ежедневное и профилактическое введение небулайзерных IgG в течение 6 месяцев пациентам с NCFB (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

При NCFB слизь дыхательных путей может выступать в качестве барьера для вдыхаемых лекарств на границе со слизистой оболочкой. В то время как нормальная слизь представляет собой тонкий слой, который позволяет IgG эффективно диффундировать в подлежащие ткани, слизь в дыхательных путях при NCFB присутствует в повышенных количествах и имеет аномальную густоту. Таким образом, нарушение количества, структуры и текучести слизи во время бронхоэктазов может ограничивать проникновение ингаляционных антител и их терапевтический потенциал. У пациентов с NCFB также часто наблюдаются хроническая бактериальная колонизация дыхательных путей и хроническое воспаление дыхательных путей, характеризующееся повышенной активностью протеаз. Они также часто страдают от обострений, которые представляют собой эпизоды усиления симптомов, вызванные патогенами (особенно P. aeruginosa и вирусом гриппа), которые требуют медицинского вмешательства, часто включая назначение антибиотиков. В условиях чрезмерного воспаления количество протеаз превосходит нейтрализующую способность эндогенных ингибиторов протеаз. Это может оказать существенное влияние на метаболизм ингаляционных АТ и ограничить их эффективность. Действительно, предыдущие отчеты показывают, что протеолиз IgG, опосредованный эластазой нейтрофильного происхождения, приводит к снижению уровня анти-P. aeruginosa фагоцитоз и уничтожение. В дополнение к эндогенным ферментам (в основном сериновым [нейтрофильным] и цистеиновым [катепсиновым] протеазам) бактериальные патогены, такие как P. aeruginosa, также секретируют протеазы, которые могут разрушать лекарства, доставляемые через дыхательные пути. Кроме того, такие патогены, как P. aeruginosa, индуцируют экспрессию муцина.

В ходе первого исследования in vitro мы оценили барьерный эффект искусственной слизи, вязкость которой находится в диапазоне вязкости, измеренной в слизи, полученной из мокроты пациентов с респираторными заболеваниями. CEPR наблюдал значительное изменение подвижности и диффузии экзогенно добавленного поликлонального IgG (CSL Behring) в зависимости от вязкости ASM. Важно отметить, что CEPR также выявил значительное снижение способности поликлональных IgG связываться с P. aeruginosa в присутствии вязкой слизи по сравнению с жидкой слизью.

Цели исследования. Основная цель - оценить влияние слизи, полученной из мокроты пациентов с НЦФБ, на связывание поликлонального IgG с Pseudomonas aeruginosa. Результаты, полученные с использованием слизи пациента NCFB, будут сравниваться с результатами, полученными с использованием искусственной слизи. Вторичными целями являются характеристики 1) экзогенной поликлональной подвижности IgG и 2) стабильности в слизи, полученной из мокроты пациентов с NCFB. Кроме того, будет изучено влияние микробной колонизации дыхательных путей на фармакодинамику IgG.

Дизайн исследования. Это исследовательское, проспективное, моноцентрическое, поперечное, интервенционное с минимальными рисками и ограничениями исследование пациентов с некистозными фиброзными бронхоэктазами (NCFB), проводимое Центром редких заболеваний легких и отделением пульмонологии Университетской больницы Тура (CHRU Tours). Пациенты, включенные в исследование, продолжат обычное наблюдение. Обычное медицинское лечение – диагностическое и/или терапевтическое – не будет изменено в результате участия в исследовании, за исключением дополнительного микробиологического исследования мокроты в рамках исследования.

Настоящее исследование будет сосредоточено на анализе биохимических и биофизических свойств терапевтического препарата поликлонального IgG в присутствии мокроты, выделенной от пациентов с НЦФБ, а точнее на способности IgG распознавать мишень. Также будут оцениваться подвижность и стабильность IgG в слизи дыхательных путей. Чтобы связать конечные точки БП, измеренные в CEPR, с клинически значимыми параметрами, сбор мокроты будет сопровождаться документацией в слизи и крови микробиологических (вирусологические и бактериологические анализы) и воспалительных (состав крови, С-реактивный белок) параметры - измерены в ЧРУ Тура.

Анализы в отделении крови будут проводиться с использованием дополнительного объема крови, взятого во время посещения, с соблюдением ограничений и противопоказаний (в соответствии с приказом от 4 апреля 2018 года статьи Л.1121-1 Здравоохранения). код). Анализ в дыхательных путях будет проводиться с использованием мокроты, собранной у пациентов. Для каждого пациента, включенного в исследование, будет запланирована одна точка анализа.

Результаты измерения. Основным результатом является количественная оценка связывания поликлональных IgG с Pseudomonas aeruginosa в присутствии слизи, полученной из мокроты пациентов с NCFB. Связывание будут оценивать с помощью полноклеточного ELISA.

Результаты будут выражены в процентах связывания по сравнению с результатом, полученным при добавлении поликлонального IgG в физиологический раствор, и будут сравниваться с препаратами искусственной слизи в диапазоне вязкости, аналогичном вязкости слизи дыхательных путей человека.

Вторичными результатами являются: (1) измерение протеолиза с помощью вестерн-блоттинга экзогенных поликлональных IgG, добавленных в слизь, полученную из мокроты пациентов с NCFB. Результаты будут выражены в процентах целостности по сравнению с результатами, полученными при добавлении поликлонального IgG в физиологический раствор, и будут сравниваться с результатами in vitro; (2) измерение подвижности с помощью FRAP экзогенных флуоресцентно меченных поликлональных IgG, добавленных в слизь, полученную из мокроты пациентов с NCFB. Результаты будут включать определение t(1/2), подвижной и неподвижной фракций по сравнению с результатами, полученными при добавлении поликлонального IgG в физиологический раствор, и будут сравниваться с результатами in vitro. Это будет сделано в CEPR. (3) влияние микробной колонизации дыхательных путей на связывание IgG, протеолиз и подвижность Ig. Образцы с микробной колонизацией (бактериальной, вирусной или грибковой) будут сравнивать с неколонизированными образцами.

Отбор и набор людей, подходящих для исследования. В исследуемую популяцию входят все пациенты в возрасте ≥ 18 лет, страдающие НЦБК и находящиеся под наблюдением центра редких легочных заболеваний / отделения пульмонологии CHRU Tours (активный список включает 181 пациента с идиопатической НЦБК на сентябрь 2023 г.). Эти пациенты регулярно посещают клинику, включая принудительную спирометрию, по крайней мере, один раз в год. В этом поперечном исследовании пациенты будут проверены на основе медицинских записей Центра редких легочных заболеваний университетской больницы Тура (CHRU Bretonneau). В частности, пациентов будут проверять на наличие хронической продукции мокроты. Предполагается, что треть всех пациентов может иметь право на участие в исследовании. Пациентам, имеющим право на участие, будет предложено принять участие либо во время планового визита в больницу, либо по телефону со стороны научного сотрудника или медсестры-исследователя. Пациентам, заинтересованным в исследовании, будет предоставлен информационный документ для получения дополнительной информации. Когда пациенты дадут устное согласие на участие в исследовании, им будет предложено посетить Центр клинических исследований (CIC Inserm 1415) больницы. Затем пациенты встречаются с исследователем. Чтобы принять участие, субъект должен соответствовать всем критериям включения и ни одному критерию невключения. Согласие будет подтверждено исследователем после встречи с испытуемым и рассмотрения письма-согласия.

Учебный визит. При включении пациент будет присутствовать на визите исследователя для записи клинического обследования и жизненно важных показателей, даты последнего острого обострения, истории болезни, лечения и респираторного опросника Святого Георгия (показатель качества жизни). Описание бронхоэктазов по данным последней компьютерной томографии (КТ), тяжесть нарушения функции легких, определенная по последним данным спирометрии (ОФВ1), и индекс тяжести бронхоэктазов будут подтверждены старшим пульмонологом.

Сбор клинических данных.

При включении пациент будет присутствовать на визите исследователя, чтобы записать:

• История болезни
• Текущее лечение
• Клиническое обследование и показатели жизненно важных функций (кровяное давление, частота сердечных сокращений, чрескожная сатурация гемоглобина-SPO2 при дыхании комнатным воздухом)
• шкала одышки mMRC
• Описание тяжести бронхоэктазов по данным последней КТ с использованием радиологически индексированной КТ-оценки бронхоэктазов (BRICS) и количества вовлеченных долей 19
• Тяжесть нарушения воздушного потока (форсированный выдох за 1 секунду – ОФВ1) по данным последней спирометрии. ОФВ1 выражается в процентах от прогнозируемого значения с использованием справочных уравнений GLI2012.
• Дата последнего острого обострения (определяется как усиление респираторных симптомов продолжительностью более 48 часов и назначение нового антибиотика)
• Количество и дата тяжелых обострений, требующих госпитализации
• Количество обострений, потребовавших антибиотикотерапии, за последний год
• Респираторный опросник Святого Георгия (показатель качества жизни)
• История колонизации дыхательных путей Pseudomonas или других бактерий.

Сбор образцов крови и вдыхаемой мокроты. После медицинской консультации медсестра ЦИК возьмет венозную кровь 3х5 мл для гематологического и биохимического анализа. 1 пробирка будет использована для иммунологического анализа, сделанного в ЦЭПР.

После взятия крови субъекты получат 0,9% аэрозоль NaCl, если SPO2 при вдыхании воздуха в помещении составляет ≥94%, и будут собраны индуцированные образцы мокроты. Ключевые этапы доставки аэрозоля и сбора мокроты:

• Пациент полоскает рот питьевой водой (чтобы уменьшить загрязнение образца слюной).
• Пациент сморкается (чтобы уменьшить загрязнение образца слизью верхних дыхательных путей).
• Начать распыление 15 мл 0,9% NaCl, подаваемого через пневматический небулайзер (воздух 6 л/мин).
• Во время и сразу после введения аэрозоля NaCl субъекту рекомендуется сплевывать жидкость в пробирку объемом 50 мл не менее 3 раз (5, 10, 15 минут).

Анализ образца. Сразу после сбора образец мокроты будет отправлен в отделения бактериологии, вирусологии и микологии CHRU Tours для характеристики микробных популяций (окраска по Граму и бактериальные культуры, окраска Гомори-Грокотта и грибковые культуры, мультиплексная РТПЦР для респираторных патогенов). Оставшийся образец мокроты затем будет отправлен в CEPR для фармакологического анализа препарата IgG. Неиспользованные или оставшиеся образцы будут храниться в CEPR в специальной коллекции для дальнейших экспериментов. Они будут храниться неограниченный период времени.

Образцы крови будут отправлены в гематологическую и биохимическую лаборатории для подсчета клеток крови и анализа С-реактивного белка. 1 пробирка будет использована для иммунологического анализа (фенотипирование нейтрофилов, измерение общего уровня IgG), проводимого в CEPR.

В рамках исследования не планируется наблюдение за субъектами.