Rola barier w interakcjach IgG-patogen na powierzchni błony śluzowej dróg oddechowych człowieka (BARRIG)

Od czasu pojawienia się technologii przeciwciał monoklonalnych, przeciwciała terapeutyczne (Ab) okazały się skuteczne w leczeniu różnych chorób. Ab radykalnie zmienił sposób postępowania i leczenia śmiertelnych chorób, od chłoniaka nieziarniczego po podtypy astmy. Sukces leków Ab opiera się na ich wysokiej selektywności, przewidywalnej toksyczności i unikalnych profilach farmakologicznych, co zapewnia im przewagę nad lekami małocząsteczkowymi. W rezultacie Ab reprezentuje najszybciej rozwijającą się klasę bioterapeutyków, a pięć z nich należy do najlepiej sprzedających się leków w USA.

Choroby układu oddechowego dotykają miliony ludzi na całym świecie; Według WHO cztery najczęstsze śmiertelne choroby płuc (zapalenie płuc, gruźlica, rak płuc i przewlekła obturacyjna choroba płuc [POChP]) są przyczyną około jednego na pięć zgonów na świecie w 2030 r. Oprócz przedwczesnej śmiertelności choroby układu oddechowego mają dramatyczny wpływ na społeczeństwo, powodując niepełnosprawność, koszty opieki zdrowotnej i utratę produktywności, co powoduje konieczność opracowania nowych terapii. Dzięki ponad 100 cząsteczkom będącym w fazie oceny klinicznej i kilkunastu przeciwciałom (Ab), które uzyskały zgodę na wprowadzenie do obrotu, Ab ma ogromną szansę przynieść korzyści pacjentom z chorobami układu oddechowego, w tym rozstrzeniami oskrzeli. Obecnie Ab jest wskazany jako strategia alternatywna lub uzupełniająca wobec środków przeciwnowotworowych, przeciwzapalnych i przeciwinfekcyjnych, w szczególności antybiotyków. Zachowanie Ab zależy od ich farmakodynamiki (PD) i farmakokinetyki (PK), które częściowo zależą od drogi podania. Dotychczas Ab na choroby układu oddechowego podawano głównie dożylnie lub podskórnie, co nie jest optymalne dla zapewnienia terapeutycznego stężenia aktywnego leku w płucach, podczas gdy inne narządy są narażone na działanie leku.

W leczeniu chorób układu oddechowego inhalacja pozwala na bezpośrednie działanie na drogi oddechowe. Inhalacja ma na celu miejscowe podanie leku – w postaci aerozolu – przez nos i/lub usta do miejsca jego działania. Inhalacja jest złotym standardem podawania leków o działaniu miejscowym w leczeniu astmy lub POChP. Inhalacja zapewnia lepszy wskaźnik terapeutyczny niektórych leków, często wymaga mniejszej dawki w porównaniu z innymi drogami i jest nieinwazyjna, co poprawia przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i komfort pacjenta. Obecnie większość (miejscowo) leków wziewnych to małe cząsteczki różnych klas. Ab to zwykle IgG pełnej długości, które są dużymi białkami heterodimerycznymi (~150 kDa), które nie dyfundują pasywnie przez bariery komórkowe. Obecnie większość Ab w chorobach układu oddechowego dostarczana jest drogą dożylną (i.v). i.v. droga może nie być optymalna dla Ab w kontekście chorób układu oddechowego, ponieważ tylko niewielka część Ab dociera do płuc/ dróg oddechowych po podaniu dożylnym. zastrzyk. Inhalacja jest atrakcyjną i wykonalną alternatywną drogą miejscowego podawania pełnej długości Ab do płuc. Ab dostarczane przez drogi oddechowe wykazują odpowiedź terapeutyczną i są w większości zatrzymywane w płucach przy niewielkiej dyfuzji ogólnoustrojowej. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te wskazują, że inhalacja może mieć przewagę nad innymi drogami podawania, jeśli Ab ma działać w drogach oddechowych.

Pomimo teoretycznych zalet miejscowego podawania Ab przez inhalację, niewiele z tych korzyści pojawiło się jeszcze w klinikach. Obecnie kilka Ab jest w fazie rozwoju klinicznego poprzez inhalację, ale żaden nie znalazł się jeszcze w klinikach. Ten niedostatek podkreśla złożoność opracowywania przeciwciał wziewnych i wskazuje na utrzymujące się przeszkody do pokonania. Aby zapewnić pomyślne przejście od fazy przedklinicznej do klinicznej, wymagane jest szczegółowe zrozumienie farmakologii wziewnego Ab. W szczególności odkładanie się aerozolu Ab podczas chorób układu oddechowego może być modulowane przez bariery biologiczne, które mogą ograniczać lub uniemożliwiać skuteczność Ab w aerozolu. Obecnie zdarzenia, które mają miejsce po odłożeniu wziewnego Ab w drogach oddechowych, nie są w pełni poznane i wymagają głębszej charakterystyki.

Rozstrzenie oskrzeli niezwiązane z mukowiscydozą (NCFB) to grupa ropnych przewlekłych chorób dróg oddechowych o różnorodnej etiologii. Klinicznie NFCB charakteryzuje się nieprawidłowym, nieodwracalnym rozszerzeniem oskrzeli, niedrożnością dróg oddechowych, przewlekłym kaszlem i zwiększoną produkcją plwociny. Na poziomie patofizjologicznym kluczową rolę odgrywają przewlekłe zapalenie, przewlekła kolonizacja bakteryjna dróg oddechowych i zwiększona produkcja śluzu w drogach oddechowych. Obecne leczenie kolonizacji drobnoustrojów i/lub ostrych zaostrzeń NFCB opiera się głównie na antybiotykach w dużych dawkach stosowanych ogólnoustrojowo lub do dróg oddechowych. Często stosuje się także długoterminową azytromycynę w małych dawkach w celu zmniejszenia stanu zapalnego dróg oddechowych, objawów i częstotliwości ostrych zaostrzeń. Ponieważ antybiotyki mogą albo nie złagodzić objawów, albo wywołać oporność drobnoustrojów, istnieje zapotrzebowanie na nowe metody leczenia poprawiające usuwanie patogenów i zmniejszające zapalenie dróg oddechowych.

Wziewna immunoglobulina poliklonalna G (IgG) to nowe podejście terapeutyczne w leczeniu NCFB. Oczekuje się, że wziewne IgG będą pośredniczyć w korzystnym działaniu w NCFB ze względu na ich zdolność do zmniejszania zakresu patogenów układu oddechowego zdolnych do infekowania dróg oddechowych, zmniejszania obciążenia płuc istniejących populacji bakterii, poprawy klirensu śluzowo-rzęskowego poprzez przywrócenie funkcji komórek nabłonkowych i zmniejszania zapalenia płuc . Rzeczywiście, pakiety danych przedklinicznych wykazały zmniejszone obciążenie patogenami i powiązane uszkodzenia komórek po zakażeniu gryzoni i naczelnych innych niż ludzie. Obecnie trwają badanie fazy 1 z udziałem pacjentów z NCFB i badanie toksykologii przewlekłej umożliwiające badanie fazy 2, obejmujące codzienne i profilaktyczne podawanie nebulizowanej IgG przez 6 miesięcy pacjentom z NCFB (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

W NCFB śluz w drogach oddechowych może działać jako bariera dla wziewnych leków na styku błony śluzowej. Podczas gdy normalny śluz ma postać cienkiej warstwy, która umożliwia skuteczną dyfuzję IgG do leżących poniżej tkanek, śluz w drogach oddechowych w NCFB występuje w zwiększonych ilościach i jest nienormalnie gęsty. Upośledzenie ilości, struktury i płynności śluzu podczas rozstrzeni oskrzeli może zatem ograniczyć przenikanie wdychanego Ab i ich potencjał terapeutyczny. U pacjentów z NCFB często występuje również przewlekła bakteryjna kolonizacja dróg oddechowych i przewlekłe zapalenie dróg oddechowych charakteryzujące się zwiększoną aktywnością proteazy. Często cierpią również na zaostrzenia, które są wywołanymi przez patogeny (zwłaszcza P. aeruginosa i wirusem grypy) epizodami nasilonych objawów, które wymagają interwencji medycznej, często obejmującej podanie antybiotyków. W kontekście nadmiernego stanu zapalnego ilość proteaz przewyższa zdolność neutralizującą endogennych inhibitorów proteaz. Może to mieć dramatyczny wpływ na metabolizm wdychanego Ab i ograniczać ich skuteczność. Rzeczywiście, poprzednie doniesienia pokazują, że proteoliza IgG, w której pośredniczy elastaza pochodząca z neutrofilów, prowadzi do zmniejszenia poziomu anty-P. aeruginosa fagocytoza i zabijanie. Oprócz enzymów endogennych (głównie proteaz serynowych [pochodzących z neutrofilów] i cysteinowych [katepsyny]), patogeny bakteryjne, takie jak P. aeruginosa, wydzielają również proteazy, które mogą rozkładać leki podawane przez drogi oddechowe. Ponadto patogeny takie jak P. aeruginosa indukują ekspresję mucyny.

W pierwszym badaniu in vitro ocenialiśmy działanie barierowe sztucznego śluzu o lepkości w zakresie lepkości mierzonej w śluzie pochodzącym z plwociny pacjentów z chorobami układu oddechowego. CEPR zaobserwował znaczącą zmianę mobilności i dyfuzji poliklonalnej IgG (CSL Behring) dodanej egzogennie, w zależności od lepkości ASM. Co ważne, CEPR określił także znaczące zmniejszenie zdolności poliklonalnej IgG do wiązania się z P. aeruginosa w obecności lepkiego śluzu w porównaniu ze śluzem płynnym.

Cele studiów. Głównym celem jest ocena wpływu śluzu pochodzącego z plwociny pacjentów z NCFB na wiązanie poliklonalnej IgG z Pseudomonas aeruginosa. Wyniki uzyskane przy użyciu śluzu pacjenta NCFB zostaną porównane z wynikami uzyskanymi przy użyciu sztucznego śluzu. Drugorzędnymi celami są charakterystyka 1) egzogennej mobilności poliklonalnych IgG i 2) stabilności w śluzie pochodzącym z plwociny pacjentów z NCFB. Ponadto zbadany zostanie wpływ kolonizacji dróg oddechowych przez drobnoustroje na farmakodynamikę IgG.

Projekt badania. Jest to eksploracyjne, prospektywne, monocentryczne, przekrojowe, interwencyjne badanie pacjentów z rozstrzeniami oskrzeli niebędące mukowiscydozą (NCFB), prowadzone przez ośrodek rzadkich chorób płuc i oddział pulmonologii szpitala uniwersyteckiego w Tours (CHRU Tours), obarczone minimalnym ryzykiem i ograniczeniami. Pacjenci włączeni do badania będą kontynuować swoją zwykłą obserwację. Udział w badaniu nie będzie modyfikował zwykłego postępowania lekarskiego – diagnostycznego i/lub terapeutycznego – za wyjątkiem dodatkowego badania mikrobiologicznego plwociny w ramach badania.

Badanie to skupi się na analizie właściwości biochemicznych i biofizycznych terapeutycznego preparatu poliklonalnego IgG w obecności plwociny wyizolowanej od pacjentów z NCFB, a dokładniej na zdolności IgG do rozpoznawania celu. Oceniona zostanie także mobilność i stabilność IgG w śluzie dróg oddechowych. W celu powiązania punktów końcowych PD – mierzonych w CEPR – z parametrami istotnymi klinicznie, do pobrania plwociny będzie dołączona dokumentacja ze śluzu i krwi mikrobiologiczna (analizy wirusologiczne i bakteriologiczne) oraz zapalna (preparat krwi, białko C-reaktywne). parametry - mierzone w CHRU Tours.

Badania przedziału krwi będą wykonywane z dodatkowej objętości krwi pobranej podczas wizyty, z zachowaniem ograniczeń i przeciwwskazań (zgodnie z zarządzeniem z dnia 4 kwietnia 2018 r. art. L.1121-1 Ustawy o zdrowiu publicznym). kod). Analiza dróg oddechowych zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem plwociny pobranej od pacjentów. Dla każdego pacjenta objętego badaniem zostanie zaplanowany pojedynczy punkt analizy.

Miary wyników. Głównym wynikiem jest ilościowe oznaczenie wiązania poliklonalnych IgG z Pseudomonas aeruginosa w obecności śluzu pochodzącego z plwociny pacjentów z NCFB. Wiązanie będzie oceniane za pomocą testu ELISA na całych komórkach.

Wyniki zostaną wyrażone jako procent wiązania w stosunku do uzyskanego po dodaniu poliklonalnej IgG do roztworu soli fizjologicznej i zostaną porównane z preparatami sztucznego śluzu w zakresie lepkości podobnym do ludzkiego śluzu dróg oddechowych.

Drugorzędne wyniki to: (1) pomiar proteolizy metodą Western-Blot egzogennej poliklonalnej IgG dodanej do śluzu pochodzącego z plwociny pacjentów z NCFB. Wyniki zostaną wyrażone jako procent integralności w stosunku do uzyskanego po dodaniu poliklonalnej IgG do roztworu soli fizjologicznej i zostaną porównane z wynikami in vitro; (2) pomiar ruchliwości metodą FRAP egzogennej, znakowanej fluorescencyjnie poliklonalnej IgG dodanej do śluzu pochodzącego z plwociny pacjentów z NCFB. Wyniki będą obejmować oznaczenie frakcji t(1/2), ruchomej i nieruchomej w porównaniu z frakcją otrzymaną po dodaniu poliklonalnej IgG do roztworu soli i zostaną porównane z wynikami in vitro. Zostanie to zrobione w CEPR. (3) wpływ kolonizacji dróg oddechowych przez drobnoustroje na wiązanie IgG, proteolizę i ruchliwość Ig. Próbki z kolonizacją drobnoustrojów (bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych) zostaną porównane z próbkami nieskolonizowanymi.

Selekcja i rekrutacja osób odpowiednich do badań. Populacja badana obejmuje wszystkich pacjentów w wieku ≥ 18 lat cierpiących na NCFB, a następnie zajętych przez ośrodek rzadkich chorób płuc/oddział pulmonologii CHRU Tours (aktywna lista obejmuje 181 pacjentów z idiopatyczną NFCB według stanu na wrzesień 2023 r.). Pacjenci ci rutynowo uczestniczą w wizytach klinicznych, obejmujących wymuszoną spirometrię, przynajmniej raz w roku. W tym przekrojowym badaniu pacjenci zostaną poddani badaniom przesiewowym na podstawie dokumentacji medycznej z Centrum Chorób Płuc Rares w szpitalu uniwersyteckim w Tours (CHRU Bretonneau). W szczególności pacjenci będą badani pod kątem przewlekłego wytwarzania plwociny. Szacuje się, że do badania może kwalifikować się jedna trzecia wszystkich pacjentów. Kwalifikujący się pacjenci zostaną zaproszeni do udziału w badaniu podczas zaplanowanej wizyty w szpitalu lub po rozmowie telefonicznej z asystentem badawczym lub pielęgniarką badawczą. Pacjenci zainteresowani badaniem otrzymają dokument informacyjny w celu uzyskania dalszych informacji. Jeżeli pacjenci wyrażą ustną zgodę na udział w badaniu, zostaną zaproszeni na wizytę do Szpitalnego Centrum Badań Klinicznych (CIC Inserm 1415). Następnie pacjenci spotkają się z badaczem. Aby wziąć udział w badaniu, pacjent musi spełniać wszystkie kryteria włączenia i nie musi spełniać żadnych kryteriów niewłączenia. Zgoda zostanie potwierdzona przez badacza po spotkaniu z pacjentem i zapoznaniu się z pismem wyrażającym zgodę.

Wizyta studyjna. Po włączeniu pacjent weźmie udział w wizycie badacza w celu zapisania badania klinicznego i parametrów życiowych, daty ostatniego ostrego zaostrzenia, historii choroby, leczenia i kwestionariusza oddechowego Świętego Jerzego (miara jakości życia). Opis rozstrzeni oskrzeli z najnowszego badania tomografii komputerowej (CT), nasilenie zaburzeń czynności płuc określone w najnowszej spirometrii (FEV1) oraz wskaźnik ciężkości rozstrzeni oskrzeli zostaną zweryfikowane przez starszego pulmonologa.

Zbieranie danych klinicznych.

Po włączeniu pacjent weźmie udział w wizycie badacza w celu zarejestrowania:

• Historia medyczna
• Aktualne leczenie
• Badanie kliniczne i parametry życiowe (ciśnienie krwi, tętno, przezskórne wysycenie hemoglobiny – SPO2 podczas oddychania powietrzem pokojowym)
• Skala duszności mMRC
• Opis ciężkości rozstrzeni oskrzeli z ostatniej tomografii komputerowej przy użyciu skali BRICS (Bronchiectasis Radiologically Indexed CT Score) i liczby zajętych płatów 19
• Nasilenie upośledzenia przepływu powietrza (wymuszony wydech w ciągu 1 sekundy – FEV1) na podstawie najnowszej spirometrii. FEV1 wyraża się jako procent wartości przewidywanej przy użyciu równań referencyjnych GLI2012
• Data ostatniego ostrego zaostrzenia (określanego jako nasilone objawy ze strony układu oddechowego trwające > 48 godzin i przepisany nowy antybiotyk)
• Liczba i data ciężkich zaostrzeń wymagających hospitalizacji
• Liczba ostrych zaostrzeń wymagających antybiotykoterapii w ciągu ostatniego roku
• Kwestionariusz oddechowy Świętego Jerzego (miernik jakości życia)
• Historia kolonizacji dróg oddechowych przez Pseudomonas lub inne bakterie

Pobieranie próbek krwi i wdychanej plwociny. Po konsultacji lekarskiej pielęgniarka CIC pobierze 3x5 ml krwi żylnej do badań hematologicznych i biochemicznych. 1 probówka zostanie wykorzystana do analizy immunologicznej wykonanej w CEPR.

Po pobraniu krwi badani otrzymają aerozol 0,9% NaCl, jeśli SPO2 podczas oddychania powietrzem w pomieszczeniu wynosi ≥94%, a także zostaną pobrane próbki indukowanej plwociny. Kluczowe etapy dostarczania aerozolu i zbierania plwociny to:

• Pacjent płucze usta wodą pitną (w celu ograniczenia zanieczyszczenia próbki śliną)
• Pacjent wydmuchuje nos (w celu ograniczenia zanieczyszczenia próbki śluzem z górnych dróg oddechowych)
• Rozpocznij nebulizację 15 ml 0,9% NaCl dostarczonego za pomocą nebulizatora pneumatycznego (6 l/min powietrza)
• W trakcie i bezpośrednio po podaniu aerozolu NaCl zachęca się pacjenta, aby co najmniej 3 razy (5, 10, 15 minut) odkrztusił się do probówki o pojemności 50 ml.

Analiza próbki. Natychmiast po pobraniu próbka plwociny zostanie wysłana do wydziałów bakteriologii, wirusologii i mikologii CHRU Tours w celu scharakteryzowania populacji drobnoustrojów (barwienie metodą Grama i hodowle bakteryjne, barwienie Gomori-Grocott i hodowle grzybów, multipleksowy RTPCR pod kątem patogenów układu oddechowego). Pozostała próbka plwociny zostanie następnie przesłana do CEPR w celu analizy farmakologicznej preparatu IgG. Niewykorzystane lub pozostałe próbki będą przechowywane w CEPR w specjalnej kolekcji do dalszych eksperymentów. Będą one przechowywane przez czas nieograniczony.

Próbki krwi zostaną przesłane do laboratoriów hematologicznych i biochemicznych w celu przeprowadzenia morfologii krwi i oznaczenia białka C-reaktywnego. 1 probówka zostanie wykorzystana do analizy immunologicznej (fenotyp neutrofilów, pomiar całkowitego IgG) wykonanej w CEPR.

W ramach badania nie planuje się żadnych dalszych obserwacji pacjenta.