Esteiden rooli IgG-patogeenivuorovaikutuksissa limakalvon pinnalla ihmisen hengitysteissä (BARRIG)

Monoklonaalisen vasta-aineteknologian käyttöönoton jälkeen terapeuttiset vasta-aineet (Ab) ovat osoittautuneet menestyksekkäiksi useiden sairauksien hoidossa. Ab muutti radikaalisti kuolemaan johtavien sairauksien hallintaa ja hoitoa aina non-Hodgkinin lymfoomasta astman alatyyppeihin. Ab:n menestys perustuu niiden korkeaan selektiivisyyteen, ennustettavaan toksisuuteen ja ainutlaatuisiin farmakologisiin profiileihin, mikä antaa niille etuja pienimolekyylisiin lääkkeisiin verrattuna. Tämän seurauksena Ab edustaa nopeimmin kasvavaa bioterapeuttisten aineiden luokkaa, joista viisi on USA:n myydyimpien lääkkeiden joukossa.

Hengityselinten sairaudet vaikuttavat miljooniin ihmisiin maailmanlaajuisesti; Neljä yleisintä kuolemaan johtanutta keuhkosairautta (keuhkokuume, tuberkuloosi, keuhkosyöpä ja krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus [COPD]) aiheuttavat WHO:n mukaan vuonna 2030 noin yhden viidestä kuolemasta maailmanlaajuisesti. Ennenaikaisen kuolleisuuden lisäksi hengitystiesairaudet vaikuttavat yhteiskuntaan dramaattisesti vammaisuuden, terveydenhuollon kustannusten ja tuottavuuden alenemisen osalta, mikä vaatii uusien hoitomuotojen tarvetta. Yli 100 kliinisessä arvioinnissa olevaa molekyyliä ja tusinaa vasta-ainetta (Ab), jotka ovat saaneet myyntiluvan, Ab:lla on valtava mahdollisuus hyötyä potilaille, joilla on hengityselinsairauksia, mukaan lukien keuhkoputkentulehdus. Tällä hetkellä Ab on tarkoitettu vaihtoehtoisiksi tai täydentäviksi strategioiksi kasvaimia ehkäiseville, anti-inflammatorisille ja infektion vastaisille aineille, erityisesti antibiooteille. Ab:n käyttäytyminen riippuu niiden farmakodynamiikasta (PD) ja farmakokinetiikasta (PK), jotka riippuvat osittain niiden antoreitistä. Tähän asti hengityselinten sairauksien Ab on annettu pääasiassa suonensisäisesti tai ihon alle, mikä ei ole optimaalista varmistamaan aktiivisen lääkkeen terapeuttista pitoisuutta keuhkoissa samalla, kun se altistaa muut elimet lääkkeelle.

Hengitystiesairauksien hoidossa inhalaatio mahdollistaa kohdistamisen suoraan hengitysteihin. Inhalaatiolla pyritään toimittamaan lääkkeet paikallisesti - aerosolina - nenän ja/tai suun kautta vaikutuskohtaan. Inhalaatio on kultainen standardi astman tai keuhkoahtaumatautien hoitoon paikallisesti vaikuttavien lääkkeiden toimittamisessa. Inhalaatio tarjoaa paremman terapeuttisen indeksin joillekin lääkkeille, vaatii usein pienemmän annoksen verrattuna muihin reitteihin ja on ei-invasiivinen, mikä parantaa hoitoon sitoutumista ja potilaan mukavuutta. Tällä hetkellä useimmat (paikallisesti käytettävät) inhaloitavat lääkkeet ovat pieniä molekyylejä eri luokista. Ab ovat yleensä täyspitkiä IgG:itä, jotka ovat suuria heterodimeerisiä proteiineja (~150 kDa), jotka eivät diffundoidu passiivisesti soluesteiden yli. Tällä hetkellä suurin osa hengitystiesairauksien Ab:sta annetaan suonensisäistä reittiä (i.v). I.v. reitti ei ehkä ole optimaalinen Ab:lle hengitystiesairauksien yhteydessä, koska vain pieni osa Ab:sta saavuttaa keuhkot/hengitystiet i.v. injektio. Inhalaatio on houkutteleva ja toteuttamiskelpoinen vaihtoehto täyspitkän Ab:n paikalliseen toimittamiseen keuhkoihin. Hengitysteiden kautta annetuilla Ab:lla on terapeuttisia vasteita ja ne pysyvät enimmäkseen keuhkoissa alhaisella systeemisellä diffuusiolla. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että inhalaatiolla voi olla etulyöntiasema muihin antoreiteihin verrattuna, kun Ab on tarkoitettu toimimaan hengitysteissä.

Huolimatta Ab:n paikallisen inhalaation antamisen teoreettisista eduista, harvat näistä eduista ovat vielä toteutuneet klinikoilla. Tällä hetkellä useita Ab on kliinisessä kehityksessä inhalaatiolla, mutta ei vielä yhtään klinikoilla. Tämä niukkuus korostaa sisäänhengitettävien vasta-aineiden kehittämisen monimutkaisuutta ja osoittaa jatkuvia esteitä, jotka on voitettava. Inhaloitavan Ab:n farmakologian yksityiskohtainen ymmärrys vaaditaan, jotta varmistetaan onnistunut siirtyminen prekliinisestä kliiniseen kehitykseen. Erityisesti Ab-aerosolin kertymistä hengitystiesairauksien aikana voidaan moduloida biologisilla esteillä, jotka voivat rajoittaa tai estää aerosolisoidun Ab:n tehokkuutta. Tällä hetkellä tapahtumat, jotka tapahtuvat sen jälkeen, kun hengitetty Ab on kertynyt hengitysteihin, ovat epätäydellisesti tunnettuja ja vaativat syvempää karakterisointia.

Ei-kystinen fibroosi bronkiektaasi (NCFB) on joukko märkiviä kroonisia hengitystiesairauksia, joilla on useita etiologioita. Kliinisesti NFCB:lle on ominaista keuhkoputkien epänormaali, palautumaton laajentuminen, hengitysteiden tukkeutuminen, krooninen yskä ja lisääntynyt ysköksen eritys. Patofysiologisella tasolla krooninen tulehdus, krooninen hengitysteiden bakteerikolonisaatio ja lisääntynyt hengitysteiden liman tuotanto ovat avainrooleja. Nykyinen mikrobien kolonisaation ja/tai NFCB:n akuuttien pahenemisvaiheiden hoito perustuu enimmäkseen suuriannoksisiin systeemisiin tai hengitysteiden kautta toimitettaviin antibiootteihin. Pieniannoksista pitkäaikaista atsitromysiiniä käytetään myös usein käytettynä vähentämään hengitysteiden tulehdusta, oireita ja akuuttien pahenemisvaiheiden esiintyvyyttä. Koska antibiootit eivät välttämättä paranna oireita tai edistävät mikrobiresistenssiä, tarvitaan uusia hoitoja patogeenien puhdistuman parantamiseksi ja hengitysteiden tulehduksen vähentämiseksi.

Inhaloitava polyklonaalinen immunoglobuliini G (IgG) on uusi terapeuttinen lähestymistapa NCFB:hen. Inhaloitavan IgG:n odotetaan välittävän hyödyllisiä vaikutuksia NCFB:ssä, koska se pystyy vähentämään hengitysteitä infektoivien hengitysteiden patogeenien määrää, vähentämään olemassa olevien bakteeripopulaatioiden keuhkokuormaa, parantamaan limakalvojen puhdistumaa palauttamalla epiteelisolujen toimintoja ja vähentämään keuhkojen tulehdusta. . Itse asiassa esikliiniset tietopaketit osoittivat pienentyneen patogeenimäärän ja siihen liittyvän soluvaurion jyrsijöillä ja kädellisillä tartunnan jälkeen. Vaiheen 1 tutkimus NCFB-potilailla ja krooninen toksikologinen tutkimus, joka mahdollistaa vaiheen 2 tutkimuksen, mukaan lukien päivittäinen ja profylaktinen sumutetun IgG:n antaminen 6 kuukauden ajan NCFB-potilaille, ovat parhaillaan käynnissä (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT040520).

NCFB:ssä hengitysteiden lima voi toimia esteenä inhaloitaville lääkkeille limakalvon rajapinnalla. Vaikka normaali lima esiintyy ohuena kerroksena, joka mahdollistaa IgG:n diffundoitumisen tehokkaasti alla oleviin kudoksiin, hengitysteiden limaa on NCFB:ssä läsnä lisääntyneitä määriä ja se on epänormaalin paksua. Liman määrän, rakenteen ja juoksevuuden heikkeneminen bronkiektaasin aikana voi siten rajoittaa sisäänhengitetyn Ab:n tunkeutumista ja niiden terapeuttista potentiaalia. Potilailla, joilla on NCFB, esiintyy myös usein kroonista hengitysteiden bakteerikolonisaatiota ja kroonista hengitysteiden tulehdusta, joille on ominaista lisääntynyt proteaasiaktiivisuus. He kärsivät myös usein pahenemisvaiheista, jotka ovat patogeenien (erityisesti P. aeruginosa ja influenssavirus) aiheuttamia lisääntyneiden oireiden jaksoja, jotka vaativat lääketieteellistä toimenpiteitä, joihin usein sisältyy antibioottien anto. Liiallisen tulehduksen yhteydessä proteaasien määrä ylittää endogeenisten proteaasi-inhibiittorien neutralointikyvyn. Tällä voi olla dramaattinen vaikutus sisäänhengitetyn Ab-aineenvaihduntaan ja rajoittaa niiden tehoa. Itse asiassa aikaisemmat raportit osoittavat, että neutrofiiliperäisen elastaasin välittämä IgG-proteolyysi johtaa anti-P:n vähenemiseen. aeruginosa fagosytoosi ja tappaminen. Endogeenisten entsyymien (pääasiassa seriini [neutrofiiliperäiset] ja kysteiini [katepsiini] proteaasit) lisäksi bakteeripatogeenit, kuten P. aeruginosa, erittävät myös proteaaseja, jotka voivat hajottaa hengitysteitse kuljetettavia lääkkeitä. Lisäksi patogeenit, kuten P. aeruginosa, indusoivat musiinin ilmentymistä.

Ensimmäisessä in vitro -tutkimuksessa arvioimme keinoliman estevaikutusta, jonka viskositeetti on sama kuin hengitystiesairauksia sairastavien potilaiden ysköksestä peräisin oleva lima. CEPR havaitsi merkittävän muutoksen ulkoisesti lisätyn polyklonaalisen IgG:n (CSL Behring) liikkuvuudessa ja diffuusiossa ASM:n viskositeetista riippuen. Tärkeää on, että CEPR määritti myös merkittävän alenemisen polyklonaalisen IgG:n kyvyssä sitoutua P. aeruginoaan viskoosin liman läsnä ollessa nestemäiseen limaan verrattuna.

Opiskelun tavoitteet. Päätavoitteena on arvioida NCFB-potilaiden ysköksestä peräisin olevan liman vaikutusta polyklonaalisen IgG:n sitoutumiseen Pseudomonas aeruginoaan. NCFB-potilaan limalla saatuja tuloksia verrataan keinotekoisella limalla saatuihin tuloksiin. Toissijaisia ​​tavoitteita ovat 1) eksogeenisen polyklonaalisen IgG-liikkuvuuden ja 2) NCFB-potilaiden ysköksestä peräisin olevan liman stabiilisuuden karakterisointi. Lisäksi selvitetään mikrobien hengitysteiden kolonisaation vaikutusta IgG:n farmakodynamiikkaan.

Opintojen suunnittelu. Tämä on tutkiva, prospektiivinen, yksikeskinen, poikkileikkaus, interventiotutkimus minimaalisilla riskeillä ja rajoituksilla potilailla, joilla on ei-kystinen fibroosi bronkiektaasi (NCFB), jota seuraa harvinaisten keuhkosairauksien keskus ja Toursin yliopistollisen sairaalan (CHRU Tours) pulmonologian osasto. Tutkimukseen osallistuvat potilaat jatkavat tavanomaista seurantaansa. Tutkimukseen osallistuminen ei muuta tavanomaista lääketieteellistä hoitoa - diagnostista ja/tai terapeuttista - lukuun ottamatta ysköksen mikrobiologista lisätutkimusta osana tutkimusta.

Tässä tutkimuksessa keskitytään terapeuttisen polyklonaalisen IgG-valmisteen biokemiallisten ja biofysikaalisten ominaisuuksien analysointiin NCFB-potilaista eristettyjen yskösten läsnä ollessa ja tarkemmin sanottuna IgG:n kykyyn tunnistaa kohde. IgG:n liikkuvuus ja stabiilisuus hengitysteiden limassa arvioidaan myös. CEPR:ssä mitattujen PD-päätepisteiden yhdistämiseksi kliinisesti merkityksellisiin parametreihin ysköksen keräämiseen liitetään mikrobiologiset (virologiset ja bakteriologiset analyysit) ja tulehdukselliset (veriformulaatio, C-reaktiivinen proteiini) dokumentaatiot limasta ja verestä. parametrit - mitattuna Toursin CHRU:ssa.

Veriosaston analyysit suoritetaan käynnin yhteydessä otetun lisäveren määrällä rajoja ja vasta-aiheita (Kansanterveyslain 4. huhtikuuta 2018 annetun määräyksen L.1121-1 mukaisesti) koodi). Hengitysteiden analyysi tehdään potilailta kerätyn ysköksen avulla. Jokaiselle tutkimukseen osallistuvalle potilaalle suunnitellaan yksi analyysipiste.

Tulostoimenpiteet. Päätulos on polyklonaalisen IgG:n Pseudomonas aeruginoaan sitoutumisen kvantifiointi NCFB-potilaiden ysköksestä peräisin olevan liman läsnä ollessa. Sitoutuminen arvioidaan kokosolu-ELISA:lla.

Tulokset ilmaistaan ​​sitoutumisprosenttina verrattuna siihen, joka saadaan, kun polyklonaalinen IgG lisätään suolaliuokseen, ja niitä verrataan keinotekoisiin limavalmisteisiin, joiden viskositeetti on samanlainen kuin ihmisen hengitysteiden liman.

Toissijaiset tulokset ovat: (1) NCFB-potilaiden ysköksestä peräisin olevaan limaan lisätyn eksogeenisen polyklonaalisen IgG:n proteolyysin mittaus Western-Blot-menetelmällä. Tulokset ilmaistaan ​​eheyden prosenttiosuutena verrattuna siihen, joka saadaan, kun polyklonaalinen IgG lisätään suolaliuokseen, ja niitä verrataan in vitro -tuloksiin; (2) NCFB-potilaiden ysköksestä peräisin olevaan limaan lisätyn eksogeenisen fluoresoivasti leimatun polyklonaalisen IgG:n liikkuvuuden mittaus FRAP:lla. Tulokset sisältävät t(1/2), liikkuvien ja liikkumattomien fraktioiden määrityksen verrattuna siihen, joka saadaan, kun polyklonaalinen IgG lisätään suolaliuokseen, ja niitä verrataan in vitro -tuloksiin. Tämä tehdään CEPR:ssä. (3) mikrobien hengitysteiden kolonisaation vaikutus IgG:n sitoutumiseen, proteolyysiin ja Ig:n liikkuvuuteen. Näytteitä, joissa on mikrobien kolonisaatio (joko bakteeri-, virus- tai sieni), verrataan kolonisoimattomiin näytteisiin.

Tutkimukseen soveltuvien henkilöiden valinta ja rekrytointi. Tutkimuspopulaatio sisältää kaikki ≥ 18-vuotiaat potilaat, jotka kärsivät NCFB:stä ja joita seuraa CHRU Toursin harvinaisten keuhkosairauksien keskus/pulmonologian osasto (aktiivinen luettelo sisältää 181 potilasta, joilla on idiopaattinen NFCB syyskuussa 2023). Nämä potilaat käyvät rutiininomaisesti klinikalla, mukaan lukien pakotettu spirometria, vähintään kerran vuodessa. Tässä poikkileikkaustutkimuksessa potilaat seulotaan Toursin yliopistosairaalan (CHRU Bretonneau) harvinaisten keuhkosairauksien keskuksen potilastietojen perusteella. Erityisesti potilaita seulotaan kroonisen ysköksen erittymisen varalta. On arvioitu, että kolmasosa kaikista potilaista voi olla kelvollinen tutkimukseen. Tukikelpoisille potilaille tarjotaan osallistumista joko sairaalakäynnin yhteydessä tai tutkimusassistentin tai tutkimushoitajan puhelimitse. Tutkimuksesta kiinnostuneille potilaille toimitetaan lisätietoasiakirja. Kun potilas antaa suullisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen, hänet kutsutaan käymään sairaalan Kliinisen tutkimuskeskuksen (CIC Inserm 1415) osastolla. Tämän jälkeen potilaat tapaavat tutkijan. Osallistuakseen koehenkilön on täytettävä kaikki osallistumiskriteerit, mutta ei yhtään ei-syöttämiskriteeriä. Tutkija vahvistaa suostumuksen tutkittavan tapaamisen ja suostumuskirjeen tarkastelun jälkeen.

Opintovierailu. Kun potilas otetaan mukaan, hän osallistuu tutkijan vierailulle kliinisen tutkimuksen ja elintoimintojen kirjaamiseksi, viimeisimmän akuutin pahenemisen päivämäärän, sairaushistorian, hoidon ja Saint Georgen hengityskyselylomakkeen (elämänlaadun mitta). Vanhempi keuhkolääkäri validoi keuhkoputkentulehdusten kuvauksen viimeisimmästä tietokonetomografiakuvauksesta (CT), viimeisimmän spirometrian (FEV1) määrittämän keuhkojen toiminnan heikkenemisen vakavuuden ja keuhkoputkentulehdusten vakavuusindeksin.

Kliinisen tiedon kerääminen.

Mukaanoton yhteydessä potilas osallistuu tutkijan vierailulle tallentaakseen:

• Lääketieteellinen historia
• Nykyinen hoito
• Kliininen tutkimus ja elintoiminnot (verenpaine, syke, perkutaaninen hemoglobiini saturaatio-SPO2 huoneilmaa hengitettäessä)
• mMRC hengenahdistusasteikko
• Kuvaus keuhkoputkentulehdusten vaikeudesta viimeisimmästä TT:stä käyttäen Bronchiectasis Radiologically Indexed CT Score (BRICS) -arvoa ja mukana olevien lohkojen lukumäärää 19
• Ilmavirran heikkenemisen vakavuus (pakotettu uloshengitys 1 sekunnissa-FEV1) viimeisimmän spirometrian perusteella. FEV1 ilmaistaan ​​prosentteina ennustetusta arvosta käyttämällä GLI2012-viiteyhtälöitä
• Viimeisimmän akuutin pahenemisen päivämäärä (määritelty lisääntyneinä hengitystieoireina, jotka kestävät yli 48 tuntia, ja uudeksi antibioottireseptiksi)
• Sairaalahoitoa vaativien vakavien pahenemisvaiheiden lukumäärä ja päivämäärä
• Antibioottihoitoa vaatineiden akuuttien pahenemisvaiheiden määrä viimeisen vuoden aikana
• Saint Georgen hengitystiekysely (elämänlaadun mitta)
• Pseudomonasin tai muiden bakteerien aiheuttama hengitysteiden kolonisaatio

Veri- ja inhaloidun ysköksen näytteenotto. Lääkärin vastaanoton jälkeen CIC-sairaanhoitaja ottaa 3x5 ml laskimoverta hematologisia ja biokemiallisia analyysejä varten. Yhtä putkea käytetään CEPR:ssä tehtävään immunologiseen analyysiin.

Verenoton jälkeen koehenkilöt saavat 0,9 % NaCl-aerosolia, jos SPO2 on huoneilmaa hengittäessään ≥ 94 %, ja indusoidut yskösnäytteet otetaan. Aerosolin annostelun ja ysköksen keräämisen tärkeimmät vaiheet ovat:

• Potilas huuhtelee suunsa juomavedellä (vähentääkseen näytteen saastumista syljen kanssa)
• Potilas puhaltaa nenään (vähentääkseen näytteen kontaminaatiota ylähengitysteiden limalla)
• Aloita 15 ml:n 0,9 % NaCl:n sumuttaminen pneumaattisella sumuttimella (6 l/min ilmaa)
• NaCl-aerosolin aikana ja välittömästi sen jälkeen koehenkilöä rohkaistaan ​​yskäämään 50 ml:n näytteenottoputkeen vähintään 3 kertaa (5, 10, 15 minuuttia).

Näyteanalyysi. Heti keräämisen jälkeen yskösnäyte lähetetään CHRU Toursin bakteriologian, virologian ja mykologian osastoille mikrobipopulaatioiden karakterisointia varten (Gram-värjäys ja bakteeriviljelmät, Gomori-Grocott-värjäys ja sieniviljelmät, multipleksinen RTPCR hengityselinten patogeeneille). Jäljelle jäänyt yskösnäyte lähetetään sitten CEPR:lle IgG-valmisteen farmakologisia analyyseja varten. Käyttämättömät tai ylijääneet näytteet säilytetään CEPR:ssä erityisessä kokoelmassa lisäkokeita varten. Niitä säilytetään rajoittamattoman ajan.

Verinäytteet lähetetään hematologian ja biokemian laboratorioihin verisolumäärää ja C-reaktiivisen proteiinin määrityksiä varten. Yhtä putkea käytetään CEPR:ssä tehtävään immunologiseen analyysiin (neutrofiilien fenotyypitys, kokonais-IgG-mittaus).

Osana tutkimusta ei ole suunniteltu aiheen seurantaa.