Papel das barreiras nas interações IgG-patógeno na superfície da mucosa nas vias aéreas humanas (BARRIG)

Desde o advento da tecnologia de anticorpos monoclonais, os anticorpos terapêuticos (Ab) provaram ser bem sucedidos no tratamento de uma variedade de doenças. Ab mudou radicalmente o manejo e o tratamento de doenças fatais, desde o linfoma não-Hodgkin até subtipos de asma. O sucesso dos Ab baseia-se na sua elevada seletividade, toxicidade previsível e perfis farmacológicos únicos, conferindo-lhes vantagens em relação aos medicamentos de moléculas pequenas. Como resultado, Ab representa a classe de bioterapêuticos que mais cresce, com cinco deles entre os medicamentos mais vendidos nos EUA.

As doenças respiratórias afectam milhões de pessoas em todo o mundo; as quatro doenças pulmonares mais comumente fatais (pneumonia, tuberculose, câncer de pulmão e doença pulmonar obstrutiva crônica [DPOC]) são responsáveis ​​por cerca de uma em cada cinco mortes em todo o mundo em 2030, de acordo com a OMS. Além da mortalidade prematura, as doenças respiratórias têm um impacto dramático na sociedade no que diz respeito à incapacidade, aos custos de saúde e à perda de produtividade, exigindo a necessidade de novas terapêuticas. Com mais de 100 moléculas sob avaliação clínica e uma dúzia de anticorpos (Ab) que receberam aprovação de comercialização, os Ab têm uma tremenda oportunidade de beneficiar pacientes com doenças respiratórias, incluindo bronquiectasias. Atualmente, os Ab são indicados como estratégias alternativas ou complementares aos agentes antitumorais, anti-inflamatórios e anti-infecciosos, em particular aos antibióticos. O comportamento do Ab depende da sua farmacodinâmica (PD) e farmacocinética (PK), que dependem em parte da sua via de administração. Até agora, os Ab para doenças respiratórias são administrados principalmente por via intravenosa ou subcutânea, o que não é ideal para garantir uma concentração terapêutica do fármaco ativo nos pulmões enquanto expõe outros órgãos ao fármaco.

Para o tratamento de doenças respiratórias, a inalação permite atingir diretamente o trato respiratório. A inalação visa administrar medicamentos topicamente - na forma de aerossol - através do nariz e/ou boca até o seu local de ação. A inalação é o padrão ouro para a administração de medicamentos com ação tópica para tratamento de asma ou DPOC. A inalação proporciona melhor índice terapêutico para alguns medicamentos, muitas vezes requer dose reduzida em comparação com outras vias e é não invasiva, melhorando assim a adesão ao tratamento e o conforto do paciente. Atualmente, a maioria dos medicamentos (tópicos) inalados são pequenas moléculas de diferentes classes. Ab são geralmente IgG completos, que são proteínas heterodiméricas grandes (~150 kDa) que não se difundem passivamente através das barreiras celulares. Atualmente, a maioria dos Ab para doenças respiratórias é administrada por via intravenosa (i.v). O i.v. A rota pode não ser ideal para Ab no contexto de doença respiratória, uma vez que apenas uma pequena fração de Ab atinge os pulmões/vias aéreas após administração intravenosa. injeção. A inalação é uma rota alternativa atraente e viável para a administração tópica de Ab completo nos pulmões. Os Ab administrados através das vias aéreas exibem respostas terapêuticas e são principalmente retidos no pulmão com baixa difusão sistêmica. No geral, essas descobertas indicam que a inalação pode ter vantagem sobre outras vias de administração quando os Ab se destinam a operar no trato respiratório.

Apesar das vantagens teóricas da administração tópica de Ab por inalação, poucos desses benefícios ainda se materializaram na clínica. Atualmente vários Ab estão em desenvolvimento clínico por inalação, mas nenhum ainda nas clínicas. Esta escassez realça a complexidade do desenvolvimento de anticorpos inalados e aponta os obstáculos persistentes a superar. É necessária uma compreensão detalhada da farmacologia do Ab inalado para garantir a transição bem-sucedida do desenvolvimento pré-clínico para o clínico. Em particular, a deposição de aerossol Ab durante doenças respiratórias pode ser modulada por barreiras biológicas, o que pode limitar ou impedir a eficácia do Ab aerossolizado. Atualmente, os eventos que ocorrem após o Ab inalado ter sido depositado nas vias aéreas são incompletamente conhecidos e requerem uma caracterização mais profunda.

A bronquiectasia não fibrose cística (NCFB) é um grupo de doenças supurativas crônicas das vias aéreas de múltiplas etiologias. Clinicamente, o NFCB é caracterizado por dilatação anormal e irreversível dos brônquios, obstrução das vias aéreas, tosse crônica e aumento da produção de expectoração. No nível fisiopatológico, a inflamação crônica, a colonização bacteriana crônica das vias aéreas e o aumento da produção de muco nas vias aéreas desempenham papéis importantes. O tratamento atual para colonização microbiana e/ou exacerbações agudas de NFCB depende principalmente de altas doses de antibióticos sistêmicos ou administrados nas vias aéreas. A azitromicina em doses baixas e de longo prazo também é usada frequentemente para reduzir a inflamação das vias aéreas, os sintomas e a frequência de exacerbações agudas. Uma vez que os antibióticos podem não melhorar os sintomas ou provocar resistência microbiana, há necessidade de novos tratamentos para melhorar a eliminação de patógenos e reduzir a inflamação das vias aéreas.

A imunoglobulina policlonal G (IgG) inalada é uma nova abordagem terapêutica para NCFB. Espera-se que a IgG inalada medie os efeitos benéficos no NCFB devido à sua capacidade de reduzir a gama de patógenos respiratórios capazes de infectar o trato respiratório, diminuir a carga pulmonar das populações bacterianas existentes, melhorar a depuração mucociliar restaurando as funções das células epiteliais e diminuir a inflamação pulmonar. . Na verdade, os pacotes de dados pré-clínicos mostraram uma carga reduzida de patógenos e danos celulares relacionados após infecção em roedores e primatas não humanos. Um ensaio de fase 1 em pacientes com NCFB e um estudo de toxicologia crônica para permitir um ensaio de fase 2, incluindo a administração diária e profilática de IgG nebulizada durante 6 meses em pacientes com NCFB, estão atualmente em andamento (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

Na NCFB, o muco das vias aéreas pode atuar como uma barreira aos medicamentos inalados na interface da mucosa. Enquanto o muco normal se apresenta como uma camada fina que permite que a IgG se difunda eficientemente para os tecidos subjacentes, o muco das vias aéreas no NCFB está presente em quantidades aumentadas e é anormalmente espesso. O comprometimento da quantidade, estrutura e fluidez do muco durante a bronquiectasia pode, assim, limitar a penetração do Ab inalado e seu potencial terapêutico. Pacientes com NCFB também apresentam frequentemente colonização bacteriana crônica das vias aéreas e inflamação crônica das vias aéreas caracterizada por aumento da atividade da protease. Eles também sofrem frequentemente de exacerbações, que são episódios de aumento de sintomas causados ​​por patógenos (principalmente P. aeruginosa e vírus influenza) que requerem intervenção médica, muitas vezes incluindo a administração de antibióticos. No contexto de inflamação excessiva, a quantidade de proteases supera a capacidade neutralizante dos inibidores endógenos de protease. Isto pode ter um impacto dramático no metabolismo do Ab inalado e limitar a sua eficácia. De facto, relatórios anteriores mostram que a proteólise de IgG mediada pela elastase derivada de neutrófilos leva a uma diminuição de anticorpos anti-P. aeruginosa fagocitose e morte. Além das enzimas endógenas (principalmente proteases de serina [derivadas de neutrófilos] e cisteína [catepsina], os patógenos bacterianos, como P. aeruginosa, também secretam proteases, que podem degradar os medicamentos administrados pelo sistema respiratório. Além disso, patógenos como P. aeruginosa induzem a expressão de mucina.

Durante um primeiro estudo in vitro, avaliamos o efeito de barreira do muco artificial com viscosidade na faixa daquela medida no muco derivado do escarro de pacientes com doenças respiratórias. O CEPR observou alteração significativa na mobilidade e difusão da IgG policlonal (CSL Behring) adicionada exogenamente, dependente da viscosidade do ASM. É importante ressaltar que o CEPR também determinou uma redução significativa na capacidade da IgG policlonal de se ligar a P. aeruginosa na presença de muco viscoso em comparação com o muco fluido.

Objetivos do estudo. O objetivo principal é avaliar o impacto do muco derivado do escarro de pacientes com NCFB na ligação de uma IgG policlonal a Pseudomonas aeruginosa. Os resultados obtidos com o muco do paciente NCFB serão comparados com os resultados obtidos com muco artificial. Os objetivos secundários são a caracterização de 1) mobilidade de IgG policlonal exógena e 2) estabilidade no muco derivado do escarro de pacientes com NCFB. Além disso, será explorado o impacto da colonização microbiana das vias aéreas na farmacodinâmica da IgG.

Desenho do estudo. Este é um estudo exploratório, prospectivo, monocêntrico, transversal, intervencionista com riscos e restrições mínimos estudo de pacientes com bronquiectasia não fibrose cística (NCFB) seguido pelo centro de doenças pulmonares raras e departamento de Pneumologia do Hospital Universitário de Tours (CHRU Tours). Os pacientes incluídos no estudo continuarão com o acompanhamento habitual. O manejo médico usual - diagnóstico e/ou terapêutico - não será modificado pela participação no estudo, exceto por um estudo microbiológico adicional de escarro como parte do estudo.

Este estudo se concentrará na análise das propriedades bioquímicas e biofísicas de uma preparação terapêutica policlonal de IgG na presença de escarro isolado de pacientes com NCFB e, mais especificamente, na capacidade do IgG de reconhecer um alvo. A mobilidade e estabilidade da IgG no muco das vias aéreas também serão avaliadas. Para associar os endpoints da DP - medidos no CEPR - com parâmetros clinicamente relevantes, a colheita de expectoração será acompanhada de documentação, no muco e no sangue, de dados microbiológicos (análises virológicas e bacteriológicas) e inflamatórios (formulação sanguínea, proteína C reativa). parâmetros - medidos no CHRU de Tours.

As análises no compartimento sanguíneo serão realizadas utilizando um volume adicional de sangue colhido no momento da visita, respeitando os limites e contra-indicações (de acordo com o despacho de 4 de abril de 2018 do artigo L.1121-1 da Lei de Saúde Pública código). A análise nas vias aéreas será realizada a partir do escarro coletado dos pacientes. Um único ponto de análise será planejado para cada paciente incluído no estudo.

Medidas de resultados. O resultado principal é a quantificação da ligação de IgG policlonal a Pseudomonas aeruginosa na presença de muco derivado de escarro de pacientes com NCFB. A ligação será avaliada por ELISA de células inteiras.

Os resultados serão expressos como uma porcentagem de ligação sobre aquela obtida quando a IgG policlonal é adicionada em solução salina e serão comparados com preparações de muco artificial em faixa de viscosidade semelhante ao muco das vias aéreas humanas.

Os resultados secundários são: (1) a medição da proteólise, por Western-Blot, de IgG policlonal exógena adicionada no muco derivado do escarro de pacientes com NCFB. Os resultados serão expressos como percentual de integridade sobre aquele obtido quando a IgG policlonal é adicionada em solução salina e serão comparados com resultados in vitro; (2) a medição da mobilidade por FRAP de IgG policlonal exógeno marcado com fluorescência adicionado ao muco derivado do escarro de pacientes com NCFB. Os resultados incluirão a determinação das frações t(1/2), móvel e imóvel sobre aquela obtida quando a IgG policlonal é adicionada em solução salina e serão comparados com resultados in vitro. Isso será feito no CEPR. (3) impacto da colonização microbiana das vias aéreas na ligação de IgG, proteólise e mobilidade de Ig. Amostras com colonização microbiana (bacteriana, viral ou fúngica) serão comparadas com amostras não colonizadas.

Seleção e recrutamento de pessoas adequadas para pesquisa. A população do estudo inclui todos os pacientes com idade ≥ 18 anos que sofrem de NCFB e acompanhados pelo centro de doenças pulmonares raras/departamento de Pneumologia do CHRU Tours (a lista ativa compreende 181 pacientes com NFCB idiopática em setembro de 2023). Esses pacientes frequentam rotineiramente consultas clínicas, incluindo espirometria forçada, pelo menos uma vez por ano. Neste estudo transversal, os pacientes serão selecionados com base em prontuários médicos do Centro de Doenças Pulmonares Raras do hospital universitário de Tours (CHRU Bretonneau). Em particular, os pacientes serão examinados quanto à produção crónica de expectoração. Estima-se que um terço de todos os pacientes podem ser elegíveis para o estudo. Os pacientes elegíveis poderão participar no momento de uma visita agendada ao hospital ou por telefone de um assistente de pesquisa ou enfermeira de pesquisa. Os pacientes interessados ​​no estudo receberão o documento informativo para maiores informações. Quando os pacientes derem consentimento oral para participar do estudo, eles serão convidados a fazer uma visita ao Centro de Investigação Clínica (CIC Inserm 1415) do hospital. Os pacientes então conhecerão um investigador. Para estar envolvido, o sujeito deve cumprir todos os critérios de inclusão e nenhum critério de não inclusão. O consentimento será confirmado pelo investigador após uma reunião com o sujeito e revisão da carta de consentimento.

Visita de estudo. Na inclusão, o paciente comparecerá à visita de um investigador para registrar o exame clínico e sinais vitais, data da última exacerbação aguda, histórico médico, tratamento e questionário respiratório de Saint George (medida de qualidade de vida). A descrição da bronquiectasia na última tomografia computadorizada (TC), a gravidade do comprometimento da função pulmonar definida pela espirometria mais recente (VEF1) e o índice de gravidade da bronquiectasia serão validados por um pneumologista sênior.

Coleta de dados clínicos.

Na inclusão, o paciente comparecerá à visita de um investigador para registrar:

• História médica
• Tratamento atual
• Exame clínico e sinais vitais (pressão arterial, frequência cardíaca, saturação percutânea de hemoglobina-SPO2 enquanto respira ar ambiente)
• Escala de dispneia mMRC
• Descrição da gravidade da bronquiectasia na última TC, usando o Bronchiectasis Radiologically Indexed CT Score (BRICS) e o número de lobos envolvidos 19
• Gravidade do comprometimento do fluxo aéreo (expiratória forçada em 1 segundo - VEF1) na espirometria mais recente. O VEF1 é expresso como porcentagem do valor previsto usando as equações de referência GLI2012
• Data da última exacerbação aguda (definida como aumento dos sintomas respiratórios com duração superior a 48 horas e nova prescrição de antibióticos)
• Número e data das exacerbações graves que exigiram hospitalização
• Número de exacerbações agudas que necessitaram de terapia antibiótica no último ano
• Questionário respiratório de Saint George (medida de qualidade de vida)
• História de colonização das vias aéreas por Pseudomonas ou outras bactérias

Coleta de amostras de sangue e escarro inalado. Após a consulta médica, 3x5 mL de sangue venoso serão coletados por uma enfermeira do CIC para análises hematológicas e bioquímicas. Será utilizado 1 tubo para análise imunológica feita no CEPR.

Após a coleta de sangue, os indivíduos receberão um aerossol de NaCl a 0,9% se o SPO2 enquanto respiram o ar ambiente for ≥94%, e amostras de escarro induzido serão coletadas. As principais etapas da administração de aerossol e coleta de escarro são:

• O paciente enxagua a boca com água potável (para reduzir a contaminação da amostra com saliva)
• O paciente assoa o nariz (para reduzir a contaminação da amostra com muco das vias aéreas superiores)
• Comece a nebulização de 15 mL de NaCl a 0,9% fornecido através de um nebulizador pneumático (6L/min de ar)
• Durante e imediatamente após o aerossol de NaCl, o sujeito é incentivado a expectorar em um tubo de amostragem de 50 mL pelo menos 3 vezes (5, 10, 15 minutos).

Análise de amostra. Imediatamente após a coleta, a amostra de escarro será enviada aos departamentos de Bacteriologia, Virologia e Micologia do CHRU Tours para caracterização das populações microbianas (coloração de Gram e culturas bacterianas, coloração de Gomori-Grocott e culturas fúngicas, multiplex RTPCR para patógenos respiratórios). A amostra de escarro restante será então enviada ao CEPR para análises farmacológicas da preparação de IgG. Amostras não utilizadas ou sobras serão mantidas no CEPR em acervo específico para posterior experimentação. Eles serão mantidos por um período de tempo irrestrito.

Amostras de sangue serão enviadas aos laboratórios de Hematologia e Bioquímica para hemograma e dosagem de Proteína C Reativa. Será utilizado 1 tubo para análise imunológica (fenotipagem de neutrófilos, dosagem de IgG total) feita no CEPR.

Nenhum acompanhamento do sujeito está agendado como parte do estudo.