VDJ-rekombinace B-buněčného receptoru po transplantaci hematopoetických kmenových buněk (VReST)

Účel a cíle

Humorní imunitní systém je klíčový pro vytvoření ochranných reakcí proti závažným mikrobiálním infekcím. Jedná se o vysoce specifickou odpověď, při které se aktivují naivní B-buněčné klony, které rozpoznávají epitopy na patogenu, klonálně se rozšiřují a diferencují na paměťové B buňky a protilátky produkující plazmatické buňky.

Specifičnost odpovědi závisí na VDJ rekombinaci, která vytváří naivní B-buněčné klony, z nichž každý má odlišný B-buněčný receptor nesoucí jedinečné variabilní (V), diverzitní (D) a spojovací segmenty. Zatímco proces VDJ rekombinace je dobře prozkoumán, není dobře stanoveno, jak/zda je VDJ rekombinace ovlivněna v B buňkách po autologní nebo alogenní transplantaci kmenových buněk. Takové znalosti mohou zlepšit strategie pro přeočkování zranitelných skupin pacientů, které vyžadují transplantaci kmenových buněk k léčbě řady hematologických poruch. Zde využijeme vzorky od jedinců před a po hematologické transplantaci kmenových buněk, abychom lépe definovali dopad na VDJ rekombinaci a klonální odpovědi na vakcinační antigeny.

Pozadí

Transplantace kmenových buněk je procedura, při které jsou většina/všechny hematopoetické buňky odstraněny z pacienta a nahrazeny novými kmenovými buňkami odvozenými od "sebe" (autologní) nebo od dárce s kompatibilním MHC. Po úspěšném přenosu kmenových buněk vzniknou nové a zdravé hematopoetické buňky. Po zákroku je imunita vůči několika onemocněním, kterým lze předcházet očkováním, ztracena nebo vážně narušena, což pacienta vystavuje riziku.

Po transplantaci jsou pacienti očkováni proti několika infekčním onemocněním podle stanoveného očkovacího schématu. To poskytuje příležitost studovat VDJ rekombinaci v situaci, kdy je imunitní systém "resetován" – porovnat a kontrastovat situaci před zákrokem, stejně jako rozdíly mezi autologní a alogenní transplantací.

Standardizované očkovací schéma založené na doporučeních Evropské konference o infekcích u leukémie (ECIL) je implementováno u pacientů po HSCT. Očkování proti pneumokokovým infekcím, kapsulárnímu Haemophilus influenzae, tetanu, záškrtu, obrně, černému kašli, covid-19 a chřipce je doporučeno všem. Další očkování může být zváženo podle preferencí pacienta.

B buňky jsou klíčové pro humorální imunitní odpovědi, protože specificky reagují na antigen a poté se diferencují na protilátky produkující plazmatické buňky a na paměťové B buňky. Důležitost tohoto pro ochranu proti primární infekci je jasně vidět při náchylnosti k závažným infekčním onemocněním, pokud je humorální imunitní systém defektní nebo po léčbě B-buňky deplečními léky, jako jsou anti-CD20 protilátky. Kromě toho vytvoření imunologické paměti nás chrání před opětovnou infekcí stejným patogenem. Kriticky důležitá pro tuto odpověď je antigenní specifičnost B-buněčného receptoru (BCR) naivních B-buněčných klonů.

BCR se skládá z imunoglobulinového těžkého a lehkého řetězce s odlišnou specifičností. Specifičnost je vytvořena VDJ rekombinací, kde se jeden z mnoha V, D a J segmentů kombinuje do VDJ oblasti těžkého řetězce a jeden z mnoha V a J segmentů se kombinuje do lehkého řetězce. Kombinace těchto zajišťuje, že vznikající naivní B-buněčné klony mají každý odlišnou a jedinečnou schopnost rozpoznat epitop. Rozmanitost, která je generována, zajišťuje, že imunitní systém může klonálně reagovat na téměř jakýkoli cizí patogen, se kterým se setká. Sekvenováním BCR B buněk je tedy možné přesně určit, které V, D nebo J segmenty byly náhodně zrekombinovány k rozpoznání specifického antigenu. T buňky procházejí podobným procesem VDJ rekombinace po dozrání v brzlíku.

Po transplantaci kmenových buněk se VJ-segment beta řetězce T-buněčného receptoru vyvíjí s relativní symetrií, ale sníženou komplexitou ve srovnání s dárcem. To může vysvětlovat, proč B buňky mohou vykazovat sníženou T-buňkami závislou somatickou hypermutaci po transplantaci. Nicméně není dobře pochopeno, zda se po autologní transplantaci kmenových buněk nebo po transplantaci od alogenního dárce objeví podobná sada B-buněčných klonů. Protože pacienti po transplantaci kmenových buněk podstupují očkování, umožní nám to podrobně studovat proces antigenně specifické VDJ rekombinace před a po "resetu" imunitního systému a spojit to s antigenně specifickými odpověďmi po očkování. Předpokládáme, že to odhalí další informace o tom, jak/zda povaha transplantace ovlivní následnou VDJ rekombinaci a povede ke změněné kapacitě nebo vzoru imunitního rozpoznávání.

Navíc bylo prokázáno, že narušené humorální imunitní odpovědi během stárnutí mohou záviset spíše na vnějších než vnitřních faktorech, které ovlivňují expresi Bcl6 a CD39 v T-buněčném kompartmentu. Potenciální dostupnost vzorků od alogenních dárců s věkovou variací umožní potenciální ověření těchto výsledků u lidí.

Popis projektu

Struktura studie

Toto je observační kohortová studie sledující pacienty po transplantaci kmenových buněk zkoumající vývoj B buněk podle standardizovaného a stanoveného očkovacího schématu podávaného jako součást klinické praxe. V současné verzi tohoto schématu ve Västerbotten jsou zahrnuta očkování proti pneumokokům, Haemophilus influenzae, COVID-19, tetanu, záškrtu, obrně a černému kašli. Očkování proti spalničkám, příušnicím a zarděnkám může být podáno po negativním testu imunity 24 měsíců po transplantaci.

Odběr vzorků

i. Odběr vzorků před zahájením imunosupresivní medikace

ii. Odběr vzorků při přijetí k transplantaci kmenových buněk

iii. Odběr vzorků před každým časovým bodem očkování až do 24 měsíců od transplantace.

iv. Při alogenní transplantaci odběr vzorků od příbuzného dárce, pokud je k dispozici (jednorázový odběr).

Analýza krevních vzorků

Charakterizace B buněk a VDJ sekvenování

Antigenně specifická identifikace B buněk; Použijeme zavedenou metodologii k detekci antigenně specifických B buněk. Stručně řečeno, biotin- a fluorochromem značený protein SARS-CoV-2 nebo hemaglutininový protein chřipky typu A bude použit k určení vakcínou specifických CD19+ CD20+ B buněk průtokovou cytometrií. Zaměříme se na buňky, které prošly thymus-dependentními B-buněčnými odpověďmi (CD27+IgD-), a fenotypujeme je na aktivační markery jako DAF a CD71.

Pro vyšetření VDJ repertoáru před a po transplantaci se budeme hlavně spoléhat na bulk sekvenování, ale můžeme podrobit vzorky single cell sekvenování, abychom odhalili, zda je párování těžkého a lehkého řetězce ovlivněno transplantací. Také se snažíme analyzovat transkripční vzorce v B buňkách, abychom odhalili specifické vzorce nebo molekuly, které aktivně předpovídají efektivní vytvoření Bmem nebo plazmablastů po transplantaci kmenových buněk. Pro transkripční vzorce provedeme 10x Chromium single cell gene expression, abychom získali single cell transkriptom z až 10 000 vakcínou specifických Bmem buněk. Kombinovanou analýzou jak fenotypových, tak transkriptomických dat budeme schopni identifikovat biomarkery nebo vzorce exprese genů, které předpovídají robustní vytvoření "posilovatelné" imunitní paměti po transplantaci kmenových buněk.