Ricombinazione VDJ del Recettore delle Cellule B Dopo Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche (VReST)

Scopo e obiettivi

Il sistema immunitario umorale è fondamentale per sviluppare risposte protettive contro gravi infezioni microbiche. Questa è una risposta altamente specifica, in cui i cloni di cellule B naïve che riconoscono epitopi su un patogeno vengono attivati, si espandono clonalmente e si differenziano in cellule B della memoria e plasmacellule produttrici di anticorpi.

La specificità della risposta dipende dalla ricombinazione VDJ che crea cloni di cellule B naïve, ciascuno con un recettore delle cellule B distinto che porta segmenti variabili (V), di diversità (D) e di giunzione unici. Sebbene il processo di ricombinazione VDJ sia ben studiato, non è ben stabilito come/se la ricombinazione VDJ sia influenzata nelle cellule B dopo il trapianto di cellule staminali autologo o allogenico. Tale conoscenza potrebbe migliorare le strategie per rivaccinare gruppi di pazienti vulnerabili che richiedono il trapianto di cellule staminali per alleviare numerosi disturbi ematologici. Qui, utilizzeremo campioni di individui prima e dopo il trapianto di cellule staminali ematologiche per definire meglio l'impatto sulla ricombinazione VDJ e sulle risposte clonali agli antigeni vaccinali.

Contesto

Il trapianto di cellule staminali è una procedura in cui la maggior parte/tutte le cellule ematopoietiche vengono eradicate da un paziente e sostituite da nuove cellule staminali derivate da "sé" (autologhe) o da un donatore compatibile per il MHC. Dopo un trasferimento di cellule staminali riuscito, emergeranno nuove cellule ematopoietiche sane. Dopo la procedura, l'immunità a diverse malattie prevenibili con vaccino viene persa o gravemente compromessa, mettendo il paziente a rischio.

Dopo il trapianto, i pazienti vengono vaccinati contro diverse malattie infettive secondo un programma vaccinale stabilito. Ciò fornisce un'opportunità per studiare la ricombinazione VDJ in una situazione in cui il sistema immunitario viene "ripristinato" - confrontare e contrapporre la situazione a prima della procedura, nonché le differenze tra trapianto autologo e allogenico.

Un programma di vaccinazione standardizzato basato sulle raccomandazioni della Conferenza Europea sulle Infezioni nella Leucemia (ECIL) viene implementato per i pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT). Vaccinazioni contro infezioni pneumococciche, haemophilus influenzae capsulato, tetano, difterite, polio, pertosse, COVID-19 e influenza sono raccomandate per tutti. Ulteriori vaccinazioni possono essere considerate in base alle preferenze del paziente.

Le cellule B sono fondamentali per le risposte immunitarie umorali, poiché rispondono specificamente a un antigene e poi si differenziano in plasmacellule produttrici di anticorpi e in cellule B della memoria. L'importanza di ciò per la protezione contro un'infezione primaria è facilmente illustrata dalla suscettibilità a gravi malattie infettive se il sistema immunitario umorale è difettoso o dopo il trattamento con farmaci che depletano le cellule B, come gli anticorpi anti-CD20. Inoltre, la generazione di memoria immunologica ci protegge dalla reinfezione con lo stesso patogeno. Di fondamentale importanza per questa risposta è la specificità antigenica del recettore delle cellule B (BCR) dei cloni di cellule B naïve.

Il BCR comprende una catena pesante e leggera di immunoglobulina con una specificità distinta. La specificità è creata dalla ricombinazione VDJ, dove uno dei numerosi segmenti V, D e J sono combinati in una regione VDJ della catena pesante, e uno dei numerosi segmenti V e J sono combinati in una catena leggera. La combinazione di questi assicura che i cloni di cellule B nascenti abbiano ciascuno una capacità distinta e unica di riconoscere un epitopo. La diversità generata assicura che il sistema immunitario possa rispondere clonalmente a quasi qualsiasi patogeno estraneo incontri. Mediante sequenziamento del BCR delle cellule B, è quindi possibile determinare esattamente quali segmenti V, D o J sono stati ricombinati casualmente per riconoscere un antigene specifico. Le cellule T subiscono un processo simile di ricombinazione VDJ dopo la maturazione nel timo.

Dopo il trapianto di cellule staminali, il segmento VJ del recettore delle cellule T della catena beta si sviluppa con una relativa simmetria ma con complessità ridotta, rispetto al donatore. Ciò potrebbe spiegare perché le cellule B possono dimostrare una ridotta ipermutazione somatica dipendente dalle cellule T dopo il trapianto. Tuttavia, non è ben compreso se un insieme simile di cloni di cellule B emergerà dopo il trapianto di cellule staminali autologo o quello di un donatore allogenico. Poiché i pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali vengono vaccinati, ciò ci permetterà di studiare da vicino il processo di ricombinazione VDJ antigen-specifica pre- e post- "ripristino" del sistema immunitario, e di collegarlo alle risposte antigen-specifiche dopo la vaccinazione. Ipotesi: ciò rivelerà ulteriori informazioni su come/se la natura del trapianto influenzerà la ricombinazione VDJ a valle e porterà a una capacità o pattern alterato di riconoscimento immunitario.

Inoltre, è stato dimostrato che le risposte immunitarie umorali compromesse durante l'invecchiamento possono dipendere da fattori estrinseci piuttosto che intrinseci che influenzano l'espressione di Bcl6 e CD39 nel compartimento delle cellule T. La potenziale disponibilità di campioni da donatori allogenici con variazione di età permetterà una potenziale verifica di questi risultati negli esseri umani.

Descrizione del progetto

Struttura dello studio

Questo è uno studio di coorte osservazionale che segue i pazienti dopo il trapianto di cellule staminali esaminando lo sviluppo delle cellule B seguendo il programma vaccinale standardizzato e stabilito somministrato come parte della pratica clinica. Nell'attuale versione di questo programma in Västerbotten, le vaccinazioni contro pneumococco, haemophilus influenzae, COVID-19, tetano, difterite, polio e pertosse sono incluse. La vaccinazione contro morbillo, parotite e rosolia può essere somministrata dopo test di immunità negativo a 24 mesi dal trapianto.

Campionamento

i. Campionamento prima dell'inizio della terapia immunosoppressiva

ii. Campionamento al momento del ricovero per trapianto di cellule staminali

iii. Campionamento prima di ogni punto temporale di vaccinazione fino a 24 mesi dal trapianto.

iv. Nel trapianto allogenico, campionamento del donatore correlato se disponibile (campionamento una volta).

Analisi del campione di sangue

Caratterizzazione delle cellule B e sequenziamento VDJ

Identificazione antigen-specifica delle cellule B; Useremo metodologie consolidate per rilevare cellule B antigen-specifiche. In breve, proteine SARS-CoV-2 o proteine emoagglutinina di tipo A dell'influenza marcate con biotina e fluorocromo saranno utilizzate per determinare cellule B CD19+ CD20+ specifiche per il vaccino mediante citometria a flusso. Ci concentreremo sulle cellule che hanno subito risposte delle cellule B dipendenti dal timo (CD27+IgD-) e fenotipizzeremo queste per marcatori di attivazione come DAF e CD71.

Per l'esame del repertorio VDJ pre- e post-trapianto, faremo principalmente affidamento sul sequenziamento in bulk ma potremmo sottoporre campioni a sequenziamento a singola cellula per rivelare se l'appaiamento di catena pesante e leggera è influenzato dal trapianto. Miriamo anche a dissocere pattern trascrizionali nelle cellule B per rivelare pattern o molecole specifiche che predicono attivamente l'istituzione efficiente di cellule B della memoria o plasmablasti dopo il trapianto di cellule staminali. Per i pattern trascrizionali, eseguiremo l'espressione genica a singola cellula 10x Chromium per fornire il trascrittoma a singola cellula da fino a 10.000 cellule B della memoria specifiche per il vaccino. Mediante analisi combinatoria di dati fenotipici e trascrittomici, saremo in grado di identificare biomarcatori o pattern di espressione genica che predicono un'istituzione robusta di memoria immunitaria "potenziabile" dopo il trapianto di cellule staminali.