Rekombinacja VDJ receptora komórek B po przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych (VReST)

Cel i założenia

Układ odpornościowy humoralny ma kluczowe znaczenie dla wywoływania ochronnych odpowiedzi na ciężkie infekcje mikrobiologiczne. Jest to wysoce specyficzna odpowiedź, w której naiwne klony komórek B rozpoznające epitopy na patogenie są aktywowane, klonalnie się rozszerzają i różnicują w komórki pamięci B oraz komórki plazmatyczne produkujące przeciwciała.

Specyficzność odpowiedzi zależy od rekombinacji VDJ, która tworzy naiwne klony komórek B, każdy z odrębnym receptorem komórek B, zawierającym unikalne segmenty zmienne (V), różnorodności (D) i łączące (J). Chociaż proces rekombinacji VDJ jest dobrze zbadany, nie jest dobrze ustalone, jak i czy rekombinacja VDJ jest zaburzona w komórkach B po autologicznym lub allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych. Taka wiedza może poprawić strategie ponownego szczepienia wrażliwych grup pacjentów wymagających przeszczepienia komórek macierzystych w celu złagodzenia szeregu zaburzeń hematologicznych. Tutaj wykorzystamy próbki od osób przed i po przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych, aby lepiej określić wpływ na rekombinację VDJ i odpowiedzi klonalne na antygeny szczepionkowe.

Tło

Przeszczepienie komórek macierzystych to procedura, w której większość/wszystkie komórki hematopoetyczne są eliminowane u pacjenta i zastępowane nowymi komórkami macierzystymi pochodzącymi od "samego siebie" (autologicznymi) lub od dawcy zgodnego pod względem MHC. Po udanym przeszczepie komórek macierzystych pojawią się nowe, zdrowe komórki hematopoetyczne. Po zabiegu odporność na kilka chorób, którym można zapobiegać poprzez szczepienia, jest utracona lub poważnie upośledzona, narażając pacjenta na ryzyko.

Po przeszczepieniu pacjenci są szczepieni przeciwko kilku chorobom zakaźnym zgodnie z ustalonym harmonogramem szczepień. Stanowi to okazję do zbadania rekombinacji VDJ w sytuacji, gdy układ odpornościowy jest "zresetowany" - porównania i skontrastowania sytuacji przed zabiegiem oraz różnic między przeszczepieniem autologicznym i allogenicznym.

U pacjentów po HSCT wdrażany jest ustandaryzowany harmonogram szczepień oparty na zaleceniach Europejskiej Konferencji ds. Zakażeń w Białaczce (ECIL). Wszystkim zaleca się szczepienia przeciwko infekcjom pneumokokowym, otoczkowemu Haemophilus influenzae, tężcowi, błonicy, polio, krztuścowi, COVID-19 i grypie. Dalsze szczepienia mogą być rozważane zgodnie z preferencjami pacjenta.

Komórki B są kluczowe dla odpowiedzi immunologicznej humoralnej, ponieważ specyficznie reagują na antygen, a następnie różnicują się w komórki plazmatyczne produkujące przeciwciała oraz w komórki pamięci B. Znaczenie tego dla ochrony przed pierwotną infekcją jest wyraźnie widoczne w podatności na ciężkie choroby zakaźne, jeśli układ odpornościowy humoralny jest wadliwy lub po leczeniu lekami wyczerpującymi komórki B, takimi jak przeciwciała anty-CD20. Ponadto, wytworzenie pamięci immunologicznej chroni nas przed ponownym zakażeniem tym samym patogenem. Kluczowe znaczenie dla tej odpowiedzi ma specyficzność antygenowa receptora komórek B (BCR) naiwnych klonów komórek B.

BCR składa się z ciężkiego i lekkiego łańcucha immunoglobuliny o odrębnej specyficzności. Specyficzność jest tworzona przez rekombinację VDJ, gdzie jeden z licznych segmentów V, D i J jest łączony w region VDJ łańcucha ciężkiego, a jeden z licznych segmentów V i J jest łączony w łańcuch lekki. Połączenie to zapewnia, że powstające naiwne klony komórek B mają każdy odrębną i unikalną zdolność rozpoznawania epitopu. Generowana różnorodność zapewnia, że układ odpornościowy może odpowiedzieć klonalnie na prawie każdy napotkany obcy patogen. Dzięki sekwencjonowaniu BCR komórek B możliwe jest zatem dokładne określenie, które segmenty V, D lub J zostały losowo zrekombinowane, aby rozpoznać konkretny antygen. Komórki T przechodzą podobny proces rekombinacji VDJ po dojrzewaniu w grasicy.

Po przeszczepieniu komórek macierzystych, segment VJ łańcucha beta receptora komórek T rozwija się z względną symetrią, ale zmniejszoną złożonością w porównaniu z dawcą. Może to wyjaśniać, dlaczego komórki B mogą wykazywać zmniejszoną zależną od komórek T somatyczną hipermutację po przeszczepie. Jednak nie jest dobrze zrozumiane, czy podobny zestaw klonów komórek B pojawi się po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych czy też po przeszczepieniu od dawcy allogenicznego. Ponieważ pacjenci po przeszczepie komórek macierzystych poddawani są szczepieniom, pozwoli nam to dokładnie zbadać proces specyficznej dla antygenu rekombinacji VDJ przed i po "zresetowaniu" układu odpornościowego oraz powiązać to z odpowiedziami specyficznymi dla antygenu po szczepieniu. Zakładamy, że ujawni to dalsze informacje na temat tego, jak i czy charakter przeszczepu wpłynie na dalszą rekombinację VDJ i doprowadzi do zmienionej zdolności lub wzorca rozpoznawania immunologicznego.

Ponadto wykazano, że upośledzone odpowiedzi immunologiczne humoralne podczas starzenia mogą zależeć od czynników zewnętrznych, a nie wewnętrznych, które wpływają na ekspresję Bcl6 i CD39 w przedziale komórek T. Potencjalna dostępność próbek od dawców allogenicznych z różnicami wieku pozwoli na potencjalne zweryfikowanie tych wyników u ludzi.

Opis projektu

Struktura badania

Jest to obserwacyjne badanie kohortowe śledzące pacjentów po przeszczepieniu komórek macierzystych, badające rozwój komórek B zgodnie ze standaryzowanym i ustalonym harmonogramem szczepień podawanym jako część praktyki klinicznej. W obecnej wersji tego harmonogramu w Västernbotten uwzględniono szczepienia przeciwko pneumokokom, Haemophilus influenzae, COVID-19, tężcowi, błonicy, polio i krztuścowi. Szczepienie przeciwko odrze, śwince i różyczce może być podane po negatywnym teście odporności w 24 miesiące od przeszczepu.

Pobieranie próbek

i. Pobieranie próbek przed rozpoczęciem leczenia immunosupresyjnego

ii. Pobieranie próbek przy przyjęciu na przeszczepienie komórek macierzystych

iii. Pobieranie próbek przed każdym punktem czasowym szczepienia aż do 24 miesięcy od przeszczepu.

iv. W przypadku przeszczepienia allogenicznego pobieranie próbek od powiązanego dawcy, jeśli dostępny (pobieranie jednorazowe).

Analiza próbek krwi

Charakteryzacja komórek B i sekwencjonowanie VDJ

Identyfikacja specyficzna dla antygenu komórek B; Wykorzystamy ustaloną metodologię do wykrywania specyficznych dla antygenu komórek B. W skrócie, biotynylowane i fluorochromowo znakowane białko SARS-CoV-2 lub białko hemaglutyniny grypy typu A zostaną wykorzystane do określenia specyficznych dla szczepionki komórek B CD19+ CD20+ za pomocą cytometrii przepływowej. Skupimy się na komórkach, które przeszły zależne od grasicy odpowiedzi komórek B (CD27+IgD-) i scharakteryzujemy je pod kątem markerów aktywacji, takich jak DAF i CD71.

Do badania repertuaru VDJ przed i po przeszczepie będziemy głównie polegać na sekwencjonowaniu zbiorczym, ale możemy poddać próbki sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, aby ujawnić, czy parowanie łańcuchów ciężkich i lekkich jest dotknięte przeszczepem. Staramy się również przeanalizować wzorce transkrypcyjne w komórek B, aby ujawnić specyficzne wzorce lub cząsteczki, które aktywnie przewidują efektywne ustanowienie komórek pamięci B lub plazmablastów po przeszczepieniu komórek macierzystych. W przypadku wzorców transkrypcyjnych wykonamy ekspresję genów pojedynczych komórek 10x Chromium, aby dostarczyć transkryptom pojedynczych komórek z nawet 10 000 specyficznych dla szczepionki komórek pamięci B. Dzięki analizie kombinatorycznej danych fenotypowych i transkryptomicznych będziemy w stanie zidentyfikować biomarkery lub wzorce ekspresji genów, które przewidują solidne ustanowienie "wzmacnianej" pamięci immunologicznej po przeszczepieniu komórek macierzystych.