Recombinação VDJ do Recetor de Células B Após Transplante de Células Estaminais Hematopoiéticas (VReST)

Finalidade e objetivos

O sistema imunitário humoral é fundamental para desencadear respostas protetoras contra infeções microbianas graves. Esta é uma resposta altamente específica, onde os clones de células B ingénuas que reconhecem epítopos num patogénio são ativados, expandem-se clonalmente e diferenciam-se em células B de memória e células plasmáticas produtoras de anticorpos.

A especificidade da resposta depende da recombinação VDJ, que cria clones de células B ingénuas, cada um com um recetor de célula B distinto que transporta segmentos variáveis (V), de diversidade (D) e de junção únicos. Embora o processo de recombinação VDJ esteja bem investigado, não está bem estabelecido como/se a recombinação VDJ é afetada nas células B após transplante de células estaminais autólogo ou alogénico. Tal conhecimento pode melhorar as estratégias para revacinar grupos de doentes vulneráveis que necessitam de transplante de células estaminais para aliviar uma série de doenças hematológicas. Aqui, utilizaremos amostras de indivíduos antes e após transplante de células estaminais hematológicas para definir melhor o impacto na recombinação VDJ e nas respostas clonais a antigénios vacinais.

Contexto

O transplante de células estaminais é um procedimento em que a maioria/todas as células hematopoiéticas são erradicadas de um doente e substituídas por novas células estaminais derivadas do "próprio" (autólogo) ou de um dador compatível em termos de MHC. Após uma transferência bem-sucedida de células estaminais, surgirão novas células hematopoiéticas saudáveis. Após o procedimento, a imunidade a várias doenças evitáveis por vacinação é perdida ou gravemente prejudicada, colocando o doente em risco.

Após o transplante, os doentes são vacinados contra várias doenças infeciosas de acordo com um calendário de vacinação estabelecido. Isto proporciona uma oportunidade para estudar a recombinação VDJ numa situação em que o sistema imunitário é "reiniciado" - comparar e contrastar a situação com antes do procedimento, bem como as diferenças entre transplante autólogo e alogénico.

Um calendário de vacinação padronizado, baseado nas recomendações da Conferência Europeia sobre Infeções na Leucemia (ECIL), é implementado em doentes submetidos a transplante de células estaminais hematológicas (HSCT). Vacinações contra infeções pneumocócicas, haemophilus influenzae encapsulado, tétano, difteria, poliomielite, tosse convulsa, covid-19 e influenza são recomendadas a todos. Pode ser considerada vacinação adicional de acordo com as preferências do doente.

As células B são críticas para as respostas imunitárias humorais, pois respondem especificamente a um antigénio e depois diferenciam-se em células plasmáticas produtoras de anticorpos e em células B de memória. A importância disto para a proteção contra uma infeção primária é prontamente ilustrada pela suscetibilidade a doenças infeciosas graves se o sistema imunitário humoral estiver defeituoso ou após tratamento com medicamentos depletores de células B, como anticorpos anti-CD20. Além disso, a geração de memória imunológica protege-nos contra a reinfeção com o mesmo patogénio. De importância crítica para esta resposta é a especificidade antigénica do recetor de célula B (BCR) dos clones de células B ingénuas.

O BCR compreende uma cadeia pesada e uma leve de imunoglobulina com uma especificidade distinta. A especificidade é criada pela recombinação VDJ, onde um dos numerosos segmentos V, D e J são combinados numa região VDJ da cadeia pesada, e um dos numerosos segmentos V e J são combinados numa cadeia leve. A combinação destes garante que os clones emergentes de células B ingénuas tenham cada um uma capacidade distinta e única de reconhecer um epítopo. A diversidade que é gerada garante que o sistema imunitário possa responder clonalmente a quase qualquer patogénio estranho que encontre. Através do sequenciamento do BCR de células B, é, portanto, possível determinar exatamente quais os segmentos V, D ou J que foram recombinados aleatoriamente para reconhecer um antigénio específico. As células T sofrem um processo semelhante de recombinação VDJ após a maturação no timo.

Após transplante de células estaminais, o segmento VJ do recetor de células T da cadeia beta desenvolve-se com uma simetria relativa, mas com complexidade reduzida, em comparação com o dador. Isto pode explicar por que as células B podem demonstrar hipermutação somática dependente de células T reduzida após o transplante. No entanto, não é bem compreendido se um conjunto semelhante de clones de células B emergirá após transplante de células estaminais autólogo ou de um dador alogénico. Uma vez que os doentes submetidos a transplante de células estaminais são vacinados, isto permitir-nos-á estudar de perto o processo de recombinação VDJ antigénio-específica antes e depois do "reinício" do sistema imunitário, e associar isto a respostas antigénio-específicas após a vacinação. Colocamos a hipótese de que isto revelará mais informações sobre como/se a natureza do transplante afetará a recombinação VDJ a jusante e levará a uma capacidade ou padrão alterado de reconhecimento imunitário.

Além disso, foi demonstrado que as respostas imunitárias humorais prejudicadas durante o envelhecimento podem depender de fatores extrínsecos, em vez de intrínsecos, que afetam a expressão de Bcl6 e CD39 no compartimento das células T. A potencial disponibilidade de amostras de dadores alogénicos com variação de idade permitirá a potencial verificação destes resultados em humanos.

Descrição do projeto

Estrutura do estudo

Este é um estudo de coorte observacional que segue doentes após transplante de células estaminais, examinando o desenvolvimento das células B após o calendário de vacinação padronizado e estabelecido dado como parte da prática clínica. Na versão atual deste calendário em Västerbotten, estão incluídas vacinações contra pneumococos, haemophilus influenzae, COVID-19, tétano, difteria, poliomielite e tosse convulsa. A vacinação contra sarampo, papeira e rubéola pode ser administrada após teste de imunidade negativo aos 24 meses do transplante.

Amostragem

i. Amostragem antes do início da medicação imunossupressora

ii. Amostragem quando admitido para transplante de células estaminais

iii. Amostragem antes de cada ponto temporal de vacinação até 24 meses após o transplante.

iv. Em transplante alogénico, amostragem do dador relacionado, se disponível (amostragem única).

Análise de amostras de sangue

Caracterização de células B e sequenciação VDJ

Identificação antigénio-específica de células B; Utilizaremos metodologia estabelecida para detetar células B antigénio-específicas. Em resumo, proteína SARS-CoV-2 ou proteína hemaglutinina do tipo A da Influenza, marcadas com biotina e fluorocromo, serão utilizadas para determinar células B CD19+ CD20+ específicas da vacina por citometria de fluxo. Concentrar-nos-emos em células que sofreram respostas de células B dependentes do timo (CD27+IgD-) e fenotiparemos estas para marcadores de ativação, como DAF e CD71.

Para exame do repertório VDJ antes e após o transplante, confiaremos principalmente no sequenciamento em massa, mas poderemos submeter amostras a sequenciação de célula única para revelar se o emparelhamento de cadeia pesada e leve é afetado pelo transplante. Também pretendemos dissecar padrões transcricionais em células B para revelar padrões ou moléculas específicos que prevejam ativamente o estabelecimento eficiente de células B de memória (Bmem) ou plasmablastos após transplante de células estaminais. Para padrões transcricionais, realizaremos expressão génica de célula única 10x Chromium para fornecer o transcriptoma de célula única de até 10.000 células Bmem específicas da vacina. Através da análise combinatória de dados fenotípicos e transcriptómicos, poderemos identificar biomarcadores ou padrões de expressão génica que prevejam o estabelecimento robusto de memória imunitária "reforçável" após transplante de células estaminais.