VDJ-rekombinaatio B-solureseptorissa verituuhematosyyttisen kantasolusiirron jälkeen (VReST)

Tarkoitus ja tavoitteet

Humoraalinen immuunijärjestelmä on ratkaisevan tärkeä suojavasteiden aikaansaamisessa vakavia mikrobitulehdusta vastaan. Tämä on erittäin spesifinen vaste, jossa patogeenin epitooppeja tunnistavat naiivit B-soluklonit aktivoituvat, laajenevat kloonaalisesti ja erilaistuvat muistisoluiksi ja vasta-aineita tuottaviksi plasmasoluiksi.

Vasteen spesifisyys riippuu VDJ-rekombinaatiosta, joka luo naiiveja B-solukloneja, joilla jokaisella on erityinen B-solureseptori, joka kantaa ainutlaatuisia muuttuvia (V), diversiteetti (D) ja liitossegmenttejä. Vaikka VDJ-rekombinaation prosessia on tutkittu perusteellisesti, ei ole vakiintunutta tietoa siitä, miten ja jos VDJ-rekombinaatio muuttuu B-soluissa autologisen tai allogeenisen kantasolusiirron jälkeen. Tällainen tietoisuus saattaa parantaa strategioita uudelleenrokottamiseen haavoittuvissa potilasryhmissä, jotka tarvitsevat kantasolusiirtoa useiden hematologisten sairauksien lievittämiseksi. Tässä tutkimuksessa hyödynnämme yksilöistä ennen ja jälkeen hematologisen kantasolusiirron otettuja näytteitä määrittääksemme paremmin VDJ-rekombinaatioon ja kloonaalisiin vasteisiin rokoteantigeeneihin kohdistuvaa vaikutusta.

Tausta

Kantasolusiirto on toimenpide, jossa useimmat/kaikki hematopoieettiset solut hävitetään potilaalta ja korvataan uusilla kantasoluilla, jotka on johdettu "itsestä" (autologinen) tai MHC-yhteensopivalta luovuttajalta. Onnistuneen kantasolusiirron jälkeen syntyy uusia ja terveitä hematopoieettisia soluja. Toimenpiteen jälkeen useisiin rokotteilla ehkäistäviin tauteihin kohdistuva immuniteetti häviää tai heikkenee vakavasti, mikä altistaa potilaan riskille.

Siirron jälkeen potilaita rokotetaan useita tartuntatauteja vastaan vakiintuneen rokotusohjelman mukaisesti. Tämä tarjoaa mahdollisuuden tutkia VDJ-rekombinaatiota tilanteessa, jossa immuunijärjestelmä "nollataan" – verrataan ja rinnastetaan tilannetta ennen toimenpidettä sekä autologisen ja allogeenisen siirron välisiä eroja.

HSCT-potilaille toteutetaan standardoitu rokotusohjelma, joka perustuu Euroopan leukemiatartuntojen konferenssin (ECIL) suosituksiin. Kaikille suositellaan rokotteita pneumokokkitartuntoja, kapsuloitua haemophilus influenzae -bakteeria, tetanusta, kurkkumätää, polioa, hinkuyskää, COVID-19:ta ja influenssaa vastaan. Lisärokotuksia voidaan harkita potilaan toiveiden mukaan.

B-solut ovat ratkaisevan tärkeitä humoraalisille immuunivasteille, koska ne vastaavat spesifisesti antigeeniin ja erilaistuvat sitten vasta-aineita tuottaviksi plasmasoluiksi ja muistisolumuotoisiksi B-soluiksi. Tämän tärkeys suojautumisessa ensitartuntaa vastaan selviää helposti, jos humoraalinen immuunijärjestelmä on viallinen tai B-soluja vähentävien lääkkeiden, kuten anti-CD20-vasta-aineiden, hoidon jälkeen. Lisäksi immunologisen muistin muodostuminen suojaa meitä uudelleentartunnalta samalla patogeenilla. Kriittisen tärkeää tälle vasteelle on naiivien B-soluklonien B-solureseptorin (BCR) antigeenispesifisyys.

BCR koostuu immunoglobuliinin raskas- ja kevytketjusta, joilla on erityinen spesifisyys. Spesifisyys syntyy VDJ-rekombinaatiossa, jossa yksi useista V-, D- ja J-segmenteistä yhdistyy raskasketjun VDJ-alueeksi, ja yksi useista V- ja J-segmenteistä yhdistyy kevytketjuksi. Näiden yhdistelmä varmistaa, että syntyvillä naiiveilla B-solukloneilla on kullakin erityinen ja ainutlaatuinen kyky tunnistaa epitooppi. Luotu diversiteetti varmistaa, että immuunijärjestelmä voi vastata kloonaalisesti lähes mihin tahansa ulkoiseen patogeeniin, jonka se kohtaa. B-solujen BCR-sekvensoinnilla on siis mahdollista määrittää tarkalleen, mitkä V-, D- tai J-segmentit ovat satunnaisesti rekombinoituneet tunnistamaan tietyn antigeenin. T-solut käyvät läpi samankaltaisen VDJ-rekombinaation prosessin kykymessä kypsymisen jälkeen.

Kantasolusiirron jälkeen T-solureseptorin beeta-ketjun VJ-segmentti kehittyy suhteellisella symmetrialla mutta alentuneella kompleksisuudella verrattuna luovuttajaan. Tämä saattaa selittää, miksi B-solut voivat osoittaa alentunutta T-soluriippuvaista somaattista hypermutaatiota siirron jälkeen. Kuitenkaan ei ole hyvin ymmärretty, ilmeneekö samanlainen joukko B-solukloneja autologisen kantasolusiirron tai allogeenisen luovuttajan siirron jälkeen. Koska kantasolusiirtopotilaat saavat rokotteita, tämä mahdollistaa antigeenispesifisen VDJ-rekombinaation prosessin tarkkan tutkimisen ennen ja jälkeen immuunijärjestelmän "nollaamisen" sekä tämän yhdistämisen rokottamisen jälkeisiin antigeenispesifisiin vasteisiin. Oletamme, että tämä paljastaa lisätietoa siitä, miten ja jos siirron luonne vaikuttaa alavirran VDJ-rekombinaatioon ja johtaa muuttuneeseen kykyyn tai kuvioon immunologiseen tunnistukseen.

Lisäksi on osoitettu, että heikentyneet humoraaliset immuunivasteet ikääntymisen aikana saattavat riippua ulkoisista pikemminkin kuin sisäisistä tekijöistä, jotka vaikuttavat Bcl6- ja CD39-ilmentymiseen T-soluosastossa. Mahdollinen näytteiden saatavuus allogeenisilta luovuttajilta ikävaihtelulla mahdollistaa näiden tulosten mahdollisen vahvistamisen ihmisillä.

Projektin kuvaus

Tutkimuksen rakenne

Tämä on havainnointiin perustuva kohorttitutkimus, joka seuraa potilaita kantasolusiirron jälkeen tutkien B-solukehitystä standardoidun ja vakiintuneen rokotusohjelman mukaisesti, joka annetaan osana kliinistä käytäntöä. Tämän ohjelman nykyisessä versiossa Västerbottenissa sisältyvät rokotteet pneumokokkeja, haemophilus influenzae -bakteeria, COVID-19:ta, tetanusta, kurkkumätää, polioa ja hinkuyskää vastaan. Tuhkarokko-, sikotauti- ja vihurirokkorokotus voidaan antaa negatiivisen immuniteettitestin jälkeen 24 kuukautta siirrosta.

Näytteenotto

i. Näytteenotto ennen immunosupressiivisen lääkityksen aloittamista

ii. Näytteenotto kantasolusiirtoon otettaessa

iii. Näytteenotto ennen jokaista rokotusajankohtaa aina 24 kuukauteen siirrosta

iv. Allogeenisessa siirrossa näytteenotto sukulaisluovuttajalta, jos saatavilla (näytteenotto kerran)

Verinäytteen analyysi

B-solujen karakterisointi ja VDJ-sekvensointi

B-solujen antigeenispesifinen tunnistaminen; käytämme vakiintunutta metodologiaa antigeenispesifisten B-solujen havaitsemiseen. Lyhyesti, biotiini- ja fluorokromimerkityt SARS-CoV-2-proteiini tai influenssan A-tyypin hemagglutiniiniproteiini hyödynnetään rokotespesifisten CD19+ CD20+ B-solujen määrittämiseen virtaussytometrialla. Keskitymme soluihin, jotka ovat käyneet läpi kykymestä riippuvan B-soluvasteen (CD27+IgD-) ja fenotyyppäämme nämä aktivaatiomarkkereille, kuten DAF ja CD71.

VDJ-repertuaarin tutkimiseksi ennen ja jälkeen siirron luotamme pääasiassa joukkosekvensointiin, mutta voimme alistaa näytteet yksittäissoluseksensointiin paljastaaksemme, vaikuttaako siirto raskas- ja kevytketjun pariliitokseen. Pyrimme myös erittelemään transkriptionaalisia kuvioita B-soluissa paljastaaksemme erityisiä kuvioita tai molekyylejä, jotka aktiivisesti ennustavat tehokasta B-muisti- tai plasmalastien muodostumista kantasolusiirron jälkeen. Transkriptionaalisia kuvioita varten suoritamme 10x Chromium -yksittäissolugeenien ilmentymisen tarjotaksemme yksittäissolutranskriptomin jopa 10 000 rokotespesifisestä B-muistisolusta. Yhdistämällä sekä fenotyypillistä että transkriptomista dataa analyysissä, pystymme tunnistamaan biomarkkereita tai geenien ilmentymiskuvioita, jotka ennustavat vankan "vahvistettavan" immunologisen muistin muodostumista kantasolusiirron jälkeen.