VDJ-рекомбинация B-клеточного рецептора после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (VReST)

Цель и задачи

Гуморальная иммунная система имеет решающее значение для формирования защитных реакций против тяжелых микробных инфекций. Это высокоспецифичный ответ, при котором нативные клоны В-клеток, распознающие эпитопы патогена, активируются, клонально расширяются и дифференцируются в В-клетки памяти и плазматические клетки, продуцирующие антитела.

Специфичность ответа зависит от VDJ-рекомбинации, которая создает нативные клоны В-клеток, каждый с уникальным В-клеточным рецептором, содержащим уникальные вариабельные (V), разнообразные (D) и соединительные сегменты. Хотя процесс VDJ-рекомбинации хорошо изучен, не до конца установлено, как и влияет ли VDJ-рекомбинация на В-клетки после аутологичной или аллогенной трансплантации стволовых клеток. Такие знания могут улучшить стратегии ревакцинации уязвимых групп пациентов, которым требуется трансплантация стволовых клеток для лечения ряда гематологических заболеваний. Здесь мы будем использовать образцы от лиц до и после гематологической трансплантации стволовых клеток, чтобы лучше определить влияние на VDJ-рекомбинацию и клональные ответы на вакцинные антигены.

Обоснование

Трансплантация стволовых клеток — это процедура, при которой большинство/все гемопоэтические клетки удаляются у пациента и заменяются новыми стволовыми клетками, полученными от «самого себя» (аутологичными) или от совместимого по HLA донора. После успешной трансплантации стволовых клеток появятся новые и здоровые гемопоэтические клетки. После процедуры иммунитет к нескольким заболеваниям, предотвращаемым вакцинацией, утрачивается или серьезно нарушается, что подвергает пациента риску.

После трансплантации пациенты вакцинируются против нескольких инфекционных заболеваний в соответствии с установленным графиком вакцинации. Это предоставляет возможность изучить VDJ-рекомбинацию в ситуации, когда иммунная система «сбрасывается» — сравнить и сопоставить ситуацию до процедуры, а также различия между аутологичной и аллогенной трансплантацией.

Стандартизированный график вакцинации на основе рекомендаций Европейской конференции по инфекциям при лейкозах (ECIL) применяется к пациентам после ТГСК. Вакцинация против пневмококковых инфекций, инкапсулированной гемофильной палочки, столбняка, дифтерии, полиомиелита, коклюша, COVID-19 и гриппа рекомендуется всем. Дальнейшая вакцинация может быть рассмотрена в соответствии с предпочтениями пациента.

В-клетки имеют решающее значение для гуморальных иммунных ответов, поскольку они специфически реагируют на антиген, а затем дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела, и в В-клетки памяти. Важность этого для защиты от первичной инфекции легко иллюстрируется восприимчивостью к тяжелым инфекционным заболеваниям, если гуморальная иммунная система дефектна или после лечения препаратами, истощающими В-клетки, такими как анти-CD20 антитела. Кроме того, формирование иммунологической памяти защищает нас от повторного заражения тем же патогеном. Критически важным для этого ответа является антиген-специфичность В-клеточного рецептора (BCR) нативных клонов В-клеток.

BCR состоит из тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина с уникальной специфичностью. Специфичность создается VDJ-рекомбинацией, при которой один из многочисленных V, D и J сегментов объединяется в VDJ-область тяжелой цепи, а один из многочисленных V и J сегментов объединяется в легкую цепь. Комбинация этих элементов обеспечивает, чтобы каждый возникающий нативный клон В-клеток имел уникальную способность распознавать эпитоп. Генерируемое разнообразие гарантирует, что иммунная система может клонально реагировать практически на любой чужеродный патоген, с которым она сталкивается. Следовательно, путем секвенирования BCR В-клеток можно точно определить, какие V, D или J сегменты были случайным образом рекомбинированы для распознавания конкретного антигена. Т-клетки проходят аналогичный процесс VDJ-рекомбинации после созревания в тимусе.

После трансплантации стволовых клеток VJ-сегмент бета-цепи Т-клеточного рецептора развивается с относительной симметрией, но сниженной сложностью по сравнению с донором. Это может объяснить, почему В-клетки могут демонстрировать сниженную Т-клеточно-зависимую соматическую гипермутацию после трансплантации. Однако до конца не понятно, возникнет ли аналогичный набор клонов В-клеток после аутологичной трансплантации стволовых клеток или после трансплантации от аллогенного донора. Поскольку пациенты после трансплантации стволовых клеток проходят вакцинацию, это позволит нам детально изучить процесс антиген-специфической VDJ-рекомбинации до и после «сброса» иммунной системы и связать это с антиген-специфическими ответами после вакцинации. Мы предполагаем, что это раскроет дополнительную информацию о том, как и повлияет ли характер трансплантации на последующую VDJ-рекомбинацию и приведет к изменению способности или паттерна иммунного распознавания.

Более того, было показано, что нарушенные гуморальные иммунные ответы при старении могут зависеть скорее от внешних, чем внутренних факторов, влияющих на экспрессию Bcl6 и CD39 в Т-клеточном компартменте. Потенциальная доступность образцов от аллогенных доноров с вариацией возраста позволит потенциально проверить эти результаты на людях.

Описание проекта

Структура исследования

Это обсервационное когортное исследование, наблюдающее за пациентами после трансплантации стволовых клеток и изучающее развитие В-клеток в соответствии со стандартизированным и установленным графиком вакцинации, проводимым в рамках клинической практики. В текущей версии этого графика в Вестерботтене включены вакцинации против пневмококка, гемофильной палочки, COVID-19, столбняка, дифтерии, полиомиелита и коклюша. Вакцинация против кори, эпидемического паротита и краснухи может быть проведена после отрицательного теста на иммунитет через 24 месяца после трансплантации.

Забор образцов

i. Забор образцов до начала иммуносупрессивной терапии

ii. Забор образцов при поступлении на трансплантацию стволовых клеток

iii. Забор образцов перед каждой точкой вакцинации до 24 месяцев после трансплантации.

iv. При аллогенной трансплантации забор образцов у родственного донора, если доступен (однократный забор).

Анализ образцов крови

Характеристика В-клеток и VDJ-секвенирование

Антиген-специфическая идентификация В-клеток; Мы будем использовать установленную методологию для обнаружения антиген-специфических В-клеток. Кратко: биотинилированные и флуорохром-меченые белки SARS-CoV-2 или гемагглютинин вируса гриппа типа A будут использоваться для определения вакцин-специфических CD19+ CD20+ В-клеток методом проточной цитометрии. Мы сосредоточимся на клетках, прошедших тимус-зависимые В-клеточные ответы (CD27+IgD-), и определим их фенотип по маркерам активации, таким как DAF и CD71.

Для исследования VDJ-репертуара до и после трансплантации мы в основном будем полагаться на массовое секвенирование, но можем подвергнуть образцы одноклеточному секвенированию, чтобы выяснить, влияет ли трансплантация на спаривание тяжелых и легких цепей. Мы также стремимся проанализировать транскрипционные паттерны в В-клетках, чтобы выявить специфические паттерны или молекулы, которые активно предсказывают эффективное формирование В-клеток памяти или плазмобластов после трансплантации стволовых клеток. Для транскрипционных паттернов мы проведем 10x Chromium одноклеточный анализ экспрессии генов, чтобы получить транскриптомы отдельных клеток от до 10 000 вакцин-специфических В-клеток памяти. Путем комбинаторного анализа как фенотипических, так и транскриптомных данных мы сможем идентифицировать биомаркеры или паттерны экспрессии генов, которые предсказывают надежное формирование «усиливаемой» иммунной памяти после трансплантации стволовых клеток.