Genomisches Profiling der Resterkrankung von Eierstockkrebs im fortgeschrittenen Stadium nach neoadjuvanter Chemotherapie

Aus dem FFPE-Block extrahierte DNA wird verwendet. Capture-Sequenzierung und Immunhistochemie werden durchgeführt.

Immunhistochemie Die formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke wurden mit einer Dicke von 4 &mgr;m auf Superfrost Plus Glasobjektträger (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) geschnitten. Diese Schnitte wurden in Xylol entparaffiniert und durch abgestufte Alkohole rehydriert. Die immunhistochemische Färbung wurde unter Verwendung eines automatischen Immunfärbungsinstruments (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Antigengewinnung wurde unter Verwendung einer Zellkonditionierungslösung (CC1; Ventana Medical Systems) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen PD-L1 (vorverdünnt, Klon SP263, Ventana Medical Systems), CD8 (vorverdünnt, Klon C8/144B, Dako, Glostrup, Dänemark), PD-1 (1:50, Klon NAT105, Cell Marque , Rocklin, CA, USA), Foxp3 (1:50, Klon 236A/E7, Abcam, Cambridge, UK), ICOS/CD278 (1:50, Klon SP98, Thermo Fisher Scientific) und LAG-3 (1:100 , Klon EPR4392(2), Abcam). Nach chromogener Visualisierung unter Verwendung eines ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt, in abgestuften Alkoholen und Xylol dehydriert und dann in Befestigungslösung eingebettet. Geeignete Positiv- und Negativkontrollen wurden gleichzeitig gefärbt, um das Färbeverfahren zu validieren.

Gezielte Capture-Sequenzierung auf NextSeq550 mit SureSelect XT Probenvorbereitung DNA wurde mit dem DNAeasy-Kit (QIAGEN, Venlo, Niederlande) aus mikrodissezierten tumorreichen Bereichen aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorschnitten extrahiert. Zweihundertfünfzig Nanogramm genomischer DNA in 50 &mgr;l TE-Puffer wurden unter Verwendung des Covaris-E220 AFA-Instruments (Covaris, Woburn, MA) mit den folgenden Einstellungen auf eine mittlere Größe von 150 bp fragmentiert: Spitzeneinfallsleistung 175 Watt, Einschaltdauer 10,0 %, Zyklen pro Burst 200 Zyklen, Laufzeit 500 Sek. bei 4oC. DNA-Fragmente wurden mittels Kapillarelektrophorese auf High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, Cat.No.5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ausgewertet. Endreparatur, 3'-Endadenylierung und Sequenzierungsadapterligation von DNA-Fragmenten wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt (SureSelect XT Reagent Kit, HSQ Kat.-Nr. G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Nach jedem Schritt wurden die Fragmente unter Verwendung von AMPure XP-Kügelchen (Kat. Nr. A63382; Beckman Coulter, High Wycombe, Großbritannien). Die resultierende DNA wurde durch 14 Zyklen PCR-Amplifikation amplifiziert (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN Kit, Kat.-Nr. Nr. 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Die Qualität des PCR-Produkts wurde durch Kapillarelektrophorese mit DNA1000 TapeScreen and Reagents (TapeSation4200, Cat.No.5067-5582, 5583; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) bewertet und die Konzentration wurde mit einem Qubit 2.0 Fluorometer (Qubit dsDNA-HS-Assay-Kit, Kat.-Nr. Nr. Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Erfassung und Anreicherung Die Zielanreicherung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (SureSelect XT Custom 0,5 Mb-2,9 Mb Bibliothek, Kat. Nr. 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Die resultierenden eingefangenen Bibliotheken mit Indexprimern wurden durch 12 PCR-Zyklen amplifiziert (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN Kit, Cat. Nr. 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) und erneut gereinigt. Quantität und Qualität der indizierten Bibliotheks-DNA wurden durch Kapillarelektrophorese mit High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, Cat.No.5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) und Qubit 2.0 Fluorometer (Qubit dsDNA HS Assay-Kit, Kat.-Nr. Nr. Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Sequenzierung Die resultierenden Bibliotheken wurden auf 4 nmol/l verdünnt und gepoolt, indem 5 μl jeder verdünnten Bibliothek zur Normalisierung kombiniert wurden. Anschließend wurde die gepoolte Bibliothek unter Verwendung von frischem 0,2 N NaOH und 200 mM Tris-HCl, pH 7, in Einzelstränge denaturiert. Eine PhiX-Kontrolle wurde auf die gleiche Weise denaturiert. Die Konzentration der endgültigen Ladebibliothek betrug 1,8 pmol/l und Phix wurde mit 1 % zugesetzt. Eine Standard-Durchflusszelle wurde auf das Illumina NextSeq550 geladen und die Sequenzierung wurde mit Paired-End-Reads von 2 x 100 bp unter Verwendung des NextSeq550-Reagenz-v2-Kits mit 300 Zyklen mit hoher Leistung durchgeführt. (Benutzerhandbuch für das NextSeq550-System, Teile-Nr. 15069765-V02, März 2016, NextSeq550-Reagenzien-V2-Kit mit hoher Leistung, 300 Zyklen, Kat.-Nr. Nr. FC-404-2004; Illumina, Kalifornien).