Геномное профилирование остаточного заболевания при запущенной стадии рака яичников после неоадъювантной химиотерапии

Будет использоваться ДНК, извлеченная из блока FFPE. Будет выполнено секвенирование захвата и иммуногистохимия.

Иммуногистохимия Фиксированные в формалине и залитые парафином блоки тканей делали срезы толщиной 4 мкм на предметные стекла Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Эти срезы депарафинизировали в ксилоле и регидратировали через градуированные спирты. Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием автоматического прибора для иммуноокрашивания (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems) в соответствии с рекомендациями производителя. Извлечение антигена проводили с использованием раствора для кондиционирования клеток (CC1; Ventana Medical Systems). Срезы инкубировали с антителами против PD-L1 (предварительно разведенные, клон SP263, Ventana Medical Systems), CD8 (предварительно разведенные, клон C8/144B, Dako, Glostrup, Дания), PD-1 (1:50, клон NAT105, Cell Marque). , Роклин, Калифорния, США), Foxp3 (1:50, клон 236A/E7, Abcam, Кембридж, Великобритания), ICOS/CD278 (1:50, клон SP98, Thermo Fisher Scientific) и LAG-3 (1:100). , клон EPR4392(2), Abcam). После хромогенной визуализации с использованием комплекта UltraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) срезы докрашивали гематоксилином, обезвоживали в спиртах и ​​ксилоле определенной степени, а затем заливали в раствор для заливки. Соответствующие положительные и отрицательные контроли окрашивали одновременно для подтверждения метода окрашивания.

Целевое секвенирование с захватом на NextSeq550 с использованием SureSelect XT. Подготовка образцов ДНК экстрагировали из микрорассеченных областей, богатых опухолями, из фиксированных формалином срезов опухолей, залитых парафином, с использованием набора DNAeasy (QIAGEN, Венло, Нидерланды). Двести пятьдесят нанограммов геномной ДНК в 50 мкл буфера TE фрагментировали до среднего размера 150 пар оснований с использованием прибора Covaris-E220 AFA (Covaris, Woburn, MA) со следующими настройками: пиковая падающая мощность 175 Вт, коэффициент заполнения 10,0%, циклы. за серию 200 циклов, время работы 500 сек при 4oC. Фрагменты ДНК оценивали с помощью капиллярного электрофореза на ленте High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, кат. № 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Репарацию концов, аденилирование 3'-конца и лигирование адаптера секвенирования фрагментов ДНК выполняли в соответствии с протоколом производителя (набор реагентов SureSelect XT, HSQ Cat. No. G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). После каждого этапа фрагменты очищали с использованием гранул AMPure XP (кат. № А63382; Beckman Coulter, Хай Уиком, Великобритания). Полученную ДНК амплифицировали с помощью 14 циклов ПЦР-амплификации (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme с набором dNTP Combo 200 RXN, кат. № 600677; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Качество продукта ПЦР оценивали с помощью капиллярного электрофореза с помощью DNA1000 TapeScreen and Reagents (TapeSation4200, кат. Набор для анализа двухцепочечной ДНК HS, кат. № Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Уолтем, Массачусетс).

Захват и обогащение Целевое обогащение выполняли в соответствии с инструкциями производителя (SureSelect XT Custom 0,5–2,9 МБ). библиотека, кат. № 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Полученные захваченные библиотеки с индексирующими праймерами амплифицировали с помощью 12 циклов ПЦР (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme с набором dNTP Combo 200 RXN, кат. № 600677; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и снова очищали. Количество и качество индексированной ДНК библиотеки проверяли с помощью капиллярного электрофореза с использованием High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, кат. Набор для анализа, кат. № Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Уолтем, Массачусетс).

Секвенирование Мы разбавляли полученные библиотеки до 4 нмоль/л и объединяли путем объединения 5 мкл каждой разбавленной библиотеки для нормализации. Затем объединенную библиотеку денатурировали в отдельные цепи с использованием свежего 0,2 н. NaOH и 200 мМ трис-HCl, pH 7. Таким же образом денатурировали контроль PhiX. Концентрация конечной загружаемой библиотеки составляла 1,8 пмоль/л, а Phix добавляли до 1%. Стандартную проточную кювету загружали в Illumina NextSeq550, и секвенирование проводили с чтением парных концов 2X100 п.н. с использованием набора реагентов NextSeq550 v2 с высокой производительностью 300 циклов. (Руководство пользователя системы NextSeq550, часть № 15069765-V02, март 2016 г., набор реагентов NextSeq550 V2, высокая производительность, 300 циклов, кат. № ФК-404-2004; Иллюмина, Калифорния).