Perfil genômico da doença residual do câncer de ovário em estágio avançado após quimioterapia neoadjuvante

O DNA extraído do bloco FFPE será utilizado. Será realizado sequenciamento de captura e imuno-histoquímica.

Imuno-histoquímica Os blocos de tecido fixados em formalina e embebidos em parafina foram seccionados com 4 µm de espessura em lâminas de vidro Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Esses cortes foram desparafinizados em xilol e reidratados em álcoois graduados. A coloração imunohistoquímica foi realizada utilizando um instrumento de imunocoloração automática (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems), de acordo com as recomendações do fabricante. A recuperação antigênica foi realizada usando uma Cell Conditioning Solution (CC1; Ventana Medical Systems). As seções foram incubadas com anticorpos contra PD-L1 (pré-diluído, clone SP263, Ventana Medical Systems), CD8 (pré-diluído, clone C8/144B, Dako, Glostrup, Dinamarca), PD-1 (1:50, clone NAT105, Cell Marque , Rocklin, CA, EUA), Foxp3 (1:50, clone 236A/E7, Abcam, Cambridge, Reino Unido), ICOS/CD278 (1:50, clone SP98, Thermo Fisher Scientific) e LAG-3 (1:100 , clone EPR4392(2), Abcam). Após visualização cromogênica usando um kit ultraView Universal DAB Detection (Ventana Medical Systems), as fatias foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas em álcoois graduados e xileno e, em seguida, embebidas em solução de montagem. Controles positivos e negativos apropriados foram corados simultaneamente para validar o método de coloração.

Sequenciamento de captura direcionado em NextSeq550 usando preparação de amostra SureSelect XT O DNA foi extraído de áreas ricas em tumor microdissecado de seções de tumor fixadas em formalina embebidas em parafina usando o kit DNAeasy (QIAGEN, Venlo, Holanda). Duzentos e cinquenta nanogramas de DNA genômico em 50μl de tampão TE foram fragmentados para um tamanho médio de 150bp usando o instrumento Covaris-E220 AFA (Covaris, Woburn, MA) com as seguintes configurações: pico de potência incidente 175 watts, fator de serviço 10,0%, ciclos por rajada 200 ciclos, tempo de execução 500 seg a 4oC. Os fragmentos de DNA foram avaliados por eletroforese capilar em High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, Cat. No. 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). O reparo da extremidade, adenilação da extremidade 3' e ligação do adaptador de sequenciamento dos fragmentos de DNA foram realizados seguindo o protocolo do fabricante (kit SureSelect XT Reagent, HSQ Cat. No.G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Após cada etapa, os fragmentos foram purificados usando grânulos AMPure XP (Cat. Nº A63382; Beckman Coulter, High Wycombe, Reino Unido). O DNA resultante foi amplificado por 14 ciclos de amplificação por PCR (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. nº 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). A qualidade do produto de PCR foi avaliada por eletroforese capilar com DNA1000 TapeScreen and Reagents (TapeSation4200, Cat.No.5067-5582, 5583; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e a concentração foi medida por Qubit 2.0 Fluorometer (Qubit Kit de ensaio dsDNA HS, cat. Nº Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Captura e enriquecimento O enriquecimento do alvo foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (SureSelect XT Custom 0.5Mb-2.9Mb biblioteca, gato. nº 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As bibliotecas capturadas resultantes com primers de indexação foram amplificadas por 12 ciclos de PCR (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. nº 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e purificados novamente. A quantidade e a qualidade do DNA da biblioteca indexada foram verificadas por eletroforese capilar com High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents (TapeSation4200, Cat. No.5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) e Qubit 2.0 Fluorometer (Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio, Cat. Nº Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Sequenciamento Diluímos as bibliotecas resultantes para 4nmol/le agrupamos combinando 5μl de cada biblioteca diluída para normalização. Subsequentemente, a biblioteca reunida foi desnaturada em cadeias simples usando NaOH 0,2 N fresco e Tris-HCl 200 mM, pH 7. Um controle PhiX foi desnaturado da mesma forma. A concentração da biblioteca de carregamento final foi de 1,8 pmol/l e Phix foi adicionado a 1%. Uma célula de fluxo padrão foi carregada no Illumina NextSeq550 e o sequenciamento foi conduzido com leituras de extremidades pareadas de 2X100bp usando o kit de reagente NextSeq550 v2 com 300 ciclos de alta produção. (Guia do usuário do sistema NextSeq550, peça nº 15069765-V02, março de 2016, Kit de reagentes NextSeq550 V2 Alta saída 300 ciclos Cat. Nº FC-404-2004; Illumina, CA).