Profilowanie genomowe choroby resztkowej zaawansowanego raka jajnika po chemioterapii neoadiuwantowej

Wykorzystane zostanie DNA wyekstrahowane z bloku FFPE. Przeprowadzone zostanie sekwencjonowanie przechwytywania i immunohistochemia.

Immunohistochemia Bloki tkankowe utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie pocięto na skrawki o grubości 4 µm na szkiełka Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Skrawki te odparafinowano w ksylenie i ponownie uwodniono za pomocą alkoholi o różnej gradacji. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono za pomocą automatycznego aparatu do barwienia immunologicznego (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems), zgodnie z zaleceniami producenta. Odzyskiwanie antygenu przeprowadzono przy użyciu roztworu do kondycjonowania komórek (CC1; Ventana Medical Systems). Skrawki inkubowano z przeciwciałami przeciwko PD-L1 (wstępnie rozcieńczony, klon SP263, Ventana Medical Systems), CD8 (wstępnie rozcieńczony, klon C8/144B, Dako, Glostrup, Dania), PD-1 (1:50, klon NAT105, Cell Marque , Rocklin, Kalifornia, USA), Foxp3 (1:50, klon 236A/E7, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania), ICOS/CD278 (1:50, klon SP98, Thermo Fisher Scientific) i LAG-3 (1:100 , klon EPR4392(2), Abcam). Po wizualizacji chromogenicznej przy użyciu zestawu ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems), skrawki barwiono kontrastowo hematoksyliną, odwadniano w stopniowanych alkoholach i ksylenie, a następnie zatapiano w roztworze do zamykania. Równocześnie barwiono odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne, aby zweryfikować metodę barwienia.

Ukierunkowane sekwencjonowanie przechwytywania na NextSeq550 przy użyciu SureSelect XT Przygotowanie próbki DNA ekstrahowano z mikrodysekcji obszarów bogatych w guzy z utrwalonych w formalinie skrawków guza zatopionych w parafinie przy użyciu zestawu DNAeasy (QIAGEN, Venlo, Holandia). Dwieście pięćdziesiąt nanogramów genomowego DNA w 50 μl buforu TE pofragmentowano do mediany wielkości 150 bp przy użyciu instrumentu Covaris-E220 AFA (Covaris, Woburn, MA) z następującymi ustawieniami: szczytowa moc padania 175 watów, współczynnik wypełnienia 10, 0%, cykle na serię 200 cykli, czas pracy 500 sek. w temp. 4oC. Fragmenty DNA oceniano za pomocą elektroforezy kapilarnej na taśmie ekranowej High Sensitivity D1000 i odczynnikach (TapeSation4200, nr kat. 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Naprawę końca, adenylację końca 3' i ligację adaptera sekwencjonowania fragmentów DNA przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (zestaw odczynników SureSelect XT, nr kat. HSQ G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Po każdym etapie fragmenty oczyszczano za pomocą kulek AMPure XP (nr kat. nr A63382; Beckman Coulter, High Wycombe, Wielka Brytania). Otrzymany DNA amplifikowano przez 14 cykli amplifikacji PCR (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme z zestawem dNTP Combo 200 RXN, nr kat. nr 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA). Jakość produktu PCR oceniono za pomocą elektroforezy kapilarnej z DNA1000 TapeScreen i Reagents (TapeSation4200, nr kat. 5067-5582, 5583; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), a stężenie zmierzono za pomocą fluorometru Qubit 2.0 (Qubit Zestaw testowy dsDNA HS, nr kat. nr Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Capture and Enrichment Wzbogacanie celu przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (SureSelect XT Custom 0,5 Mb-2,9 Mb biblioteka, kat. nr 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA). Powstałe wychwycone biblioteki ze starterami indeksującymi amplifikowano przez 12 cykli PCR (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme z zestawem dNTP Combo 200 RXN, Cat. nr 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i ponownie oczyszczono. Ilość i jakość zindeksowanego DNA biblioteki zweryfikowano za pomocą elektroforezy kapilarnej z taśmą przesiewową i odczynnikami High Sensitivity D1000 (TapeSation4200, nr kat. 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i fluorometrem Qubit 2.0 (Qubit dsDNA HS Zestaw testowy, kat. nr Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Sekwencjonowanie Rozcieńczyliśmy otrzymane biblioteki do 4 nmol/l i połączyliśmy przez połączenie 5 μl każdej rozcieńczonej biblioteki w celu normalizacji. Następnie połączoną bibliotekę zdenaturowano na pojedyncze nici przy użyciu świeżego 0,2 N NaOH i 200 mM Tris-HCl, pH 7. Kontrolę PhiX denaturowano w ten sam sposób. Stężenie końcowej załadowanej biblioteki wynosiło 1,8 pmol/l, a Phix dodano w ilości 1%. Standardową komórkę przepływową załadowano na Illumina NextSeq550 i przeprowadzono sekwencjonowanie z odczytami sparowanych końców 2X100 bp przy użyciu zestawu odczynników NextSeq550 v2 z wysokowydajnymi 300 cyklami. (Podręcznik użytkownika systemu NextSeq550, nr części 15069765-V02, marzec 2016 r., zestaw odczynników NextSeq550 V2 o dużej wydajności, 300 cykli, nr kat. nr FC-404-2004; Ilumina, Kalifornia).