Az előrehaladott stádiumú petefészekrák reziduális betegségének genomiális profilja neoadjuváns kemoterápia után

Az FFPE blokkból kivont DNS-t használjuk. Elvégezzük a rögzítési szekvenálást és az immunhisztokémiát.

Immunhisztokémia A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szövetblokkokat 4 µm vastagságban Superfrost Plus üveglemezekre metszették (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ezeket a metszeteket xilolban paraffinmentesítettük, és osztályozott alkoholokon keresztül rehidratáltuk. Az immunhisztokémiai festést automata immunfestő műszerrel (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems) végeztük, a gyártó ajánlásai szerint. Az antigén-kinyerést Cell Conditioning Solution (CC1; Ventana Medical Systems) segítségével végeztük. A metszeteket PD-L1 (előhígított, klón SP263, Ventana Medical Systems), CD8 (előhígított, C8/144B klón, Dako, Glostrup, Dánia), PD-1 (1:50, NAT105 klón, Cell Marque) elleni antitestekkel inkubáltuk. , Rocklin, CA, USA), Foxp3 (1:50, klón 236A/E7, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), ICOS/CD278 (1:50, klón SP98, Thermo Fisher Scientific) és LAG-3 (1:100) , EPR4392(2), Abcam klón). Az ultraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) segítségével végzett kromogén vizualizációt követően a szeleteket hematoxilinnel ellenfestettük, osztályozott alkoholokban és xilolban dehidratáltuk, majd rögzítőoldatba ágyaztuk. A megfelelő pozitív és negatív kontrollokat egyidejűleg megfestettük a festési módszer validálására.

Célzott rögzítési szekvenálás a NextSeq550-en SureSelect XT minta-előkészítéssel A DNS-t mikrodisszekált, tumorban gazdag területekről vontuk ki formalinnal fixált paraffinba ágyazott tumormetszetekből DNAeasy kit (QIAGEN, Venlo, Hollandia) segítségével. Kétszázötven nanogramm genomiális DNS-t 50 μl TE pufferben 150 bp medián méretre fragmentáltunk a Covaris-E220 AFA készülék (Covaris, Woburn, MA) segítségével a következő beállításokkal: csúcsteljesítmény 175 watt, terhelési tényező 10,0%, ciklusok sorozatonként 200 ciklus, futási idő 500 mp 4oC-on. A DNS-fragmenseket kapilláris elektroforézissel értékeltük High Sensitivity D1000 ScreenTape és reagenseken (TapeSation4200, katalógusszám: 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A DNS-fragmensek végjavítását, 3'-végi adenilezését és szekvenáló adapterligálását a gyártó protokollja szerint végeztük (SureSelect XT Reagent kit, HSQ katalógusszám: G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Minden egyes lépés után a fragmentumokat AMPure XP gyöngyökkel (Cat. No. A63382; Beckman Coulter, High Wycombe, Egyesült Királyság). A kapott DNS-t 14 ciklusos PCR-amplifikációval amplifikáltuk (SureSelect HerculaseⅡ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. No. 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A PCR termék minőségét kapilláris elektroforézissel határoztuk meg DNA1000 TapeScreen és reagensekkel (TapeSation4200, katalógusszám: 5067-5582, 5583; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), és a koncentrációt Qubit 2.0 Fluorometerrel (Qubitometer) mértük. dsDNA HS Assay Kit, Cat. No. Q32854; Thermofisher Scientific, Inc., Waltham, MA).

Rögzítés és dúsítás A cél dúsítása a gyártó utasításai szerint történt (SureSelect XT Custom 0,5Mb-2,9Mb könyvtár, kat. No. 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Az eredményül kapott indexáló primerekkel rögzített könyvtárakat 12 PCR-ciklussal amplifikáltuk (SureSelect HerculaseⅡ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. No. 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és újra megtisztítottuk. Az indexelt könyvtár DNS mennyiségét és minőségét kapilláris elektroforézissel ellenőriztük High Sensitivity D1000 ScreenTape és reagensek (TapeSation4200, katalógusszám 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és Qubit 2.0 Flubitometer (Qubit 2.0 Flubitometer) segítségével. Assay Kit, Cat. No. Q32854; Thermofisher Scientific, Inc., Waltham, MA).

Szekvenálás A kapott könyvtárakat 4 nmol/l-re hígítottuk, és mindegyik hígított könyvtárból 5 μl-t egyesítettünk a normalizáláshoz. Ezt követően az egyesített könyvtárat egyszálúvá denaturáltuk friss 0,2 N NaOH és 200 mM Tris-HCl (pH7) alkalmazásával. Egy PhiX kontrollt ugyanígy denaturáltunk. A végső betöltési könyvtár koncentrációja 1,8 pmol/l volt, és a Phix-et 1%-ra növeltük. Egy szabványos áramlási cellát töltöttünk az Illumina NextSeq550-re, és a szekvenálást 2x100 bp-os páros végű leolvasásokkal végeztük, NextSeq550 v2 reagenskészlettel, nagy teljesítményű 300 ciklussal. (NextSeq550 rendszer felhasználói kézikönyv, 15069765-V02, 2016. márc. rész, NextSeq550 V2 reagens készlet Nagy teljesítményű, 300 ciklus kat. sz. FC-404-2004; Illumina, CA).