Pitkälle edenneen munasarjasyövän jäännössairauden genominen profilointi neoadjuvanttikemoterapian jälkeen

FFPE-lohkosta uutettua DNA:ta käytetään. Suoritetaan sieppaussekvensointi ja immunohistokemia.

Immunohistokemia Formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudoslohkot leikattiin 4 um:n paksuisiksi Superfrost Plus -lasilevyille (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Näistä leikkeistä tehtiin parafiini ksyleenissä ja hydratoitiin uudelleen lajiteltujen alkoholien läpi. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttämällä automaattista immunovärjäyslaitetta (Ventana Benchmark XT; Ventana Medical Systems) valmistajan suositusten mukaisesti. Antigeenin haku suoritettiin käyttämällä Cell Conditioning Solution -liuosta (CC1; Ventana Medical Systems). Leikkeet inkuboitiin vasta-aineilla PD-L1:tä (esilaimennettu, klooni SP263, Ventana Medical Systems), CD8:aa (esilaimennettu, klooni C8/144B, Dako, Glostrup, Tanska), PD-1:tä (1:50, klooni NAT105, Cell Marque) vastaan. , Rocklin, CA, USA), Foxp3 (1:50, klooni 236A/E7, Abcam, Cambridge, UK), ICOS/CD278 (1:50, klooni SP98, Thermo Fisher Scientific) ja LAG-3 (1:100) , klooni EPR4392(2), Abcam). UltraView Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems) avulla suoritetun kromogeenisen visualisoinnin jälkeen viipaleet vastavärjättiin hematoksyliinillä, dehydratoitiin lajiteltuissa alkoholeissa ja ksyleenissä ja upotettiin sitten asennusliuokseen. Sopivat positiiviset ja negatiiviset kontrollit värjättiin samanaikaisesti värjäysmenetelmän validoimiseksi.

Kohdennettu sieppaussekvensointi NextSeq550:llä käyttäen SureSelect XT -näytteen valmistelua DNA uutettiin mikroleikatuilta, runsaasti kasvaneilta sisältäviltä alueilta formaliinilla kiinnitetyistä parafiiniin upotetuista kasvainleikkeistä käyttämällä DNAeasy-pakkausta (QIAGEN, Venlo, Alankomaat). Kaksisataaviisikymmentä nanogrammaa genomista DNA:ta 50 μl:ssa TE-puskuria fragmentoitiin mediaanikokoon 150 bp käyttämällä Covaris-E220 AFA -laitetta (Covaris, Woburn, MA) seuraavilla asetuksilla: huippukohtausteho 175 wattia, käyttökerroin 10,0 %, jaksot. purskea kohti 200 sykliä, ajoaika 500 sekuntia 4oC:ssa. DNA-fragmentit arvioitiin käyttämällä kapillaarielektroforeesia High Sensitivity D1000 ScreenTape ja -reagensseilla (TapeSation4200, luettelonro 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). DNA-fragmenttien pään korjaus, 3'-pään adenylointi ja sekvensointiadapteriligaatio suoritettiin noudattaen valmistajan protokollaa (SureSelect XT Reagent Kit, HSQ luettelonro G9611A, G9611B; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Jokaisen vaiheen jälkeen fragmentit puhdistettiin käyttämällä AMPure XP -helmiä (Cat. nro A63382; Beckman Coulter, High Wycombe, Iso-Britannia). Saatu DNA monistettiin 14 syklin PCR-monistuksella (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. nro 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). PCR-tuotteen laatu arvioitiin kapillaarielektroforeesilla DNA1000 TapeScreenilla ja reagensseilla (TapeSation4200, luettelonro 5067-5582, 5583; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja pitoisuus mitattiin Qubit 2.0 Fluorometrillä (Qubitometer). dsDNA HS Assay Kit, Cat. nro Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Sieppaus ja rikastus Kohteen rikastus suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (SureSelect XT Custom 0.5Mb-2.9Mb kirjasto, Cat. nro 5190-4816, 4817; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Tuloksena saadut siepatut kirjastot, joissa oli indeksointialukkeita, monistettiin 12 PCR-syklillä (SureSelect Herculase Ⅱ Fusion Enzyme with dNTP Combo 200 RXN kit, Cat. nro 600677; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja puhdistettu uudelleen. Indeksoidun kirjasto-DNA:n määrä ja laatu varmistettiin kapillaarielektroforeesilla High Sensitivity D1000 ScreenTape ja -reagensseilla (TapeSation4200, luettelonro 5067-5584, 5585; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja Qubit 2.0 Flubitometer (Qubit 2.0 Flubitometer) Assay Kit, Cat. nro Q32854; Thermofisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

Sekvensointi Laimensimme tuloksena saadut kirjastot 4 nmol/l:ksi ja yhdistesimme yhdistämällä 5 µl kutakin laimennettua kirjastoa normalisointia varten. Sen jälkeen yhdistetty kirjasto denaturoitiin yksittäisiksi juosteiksi käyttämällä tuoretta 0,2 N NaOH:a ja 200 mM Tris-HCl:a, pH 7. PhiX-kontrolli denaturoitiin samalla tavalla. Lopullisen latauskirjaston pitoisuus oli 1,8 pmol/l ja Phix oli lisätty 1 %:iin. Standardivirtauskenno ladattiin Illumina NextSeq550:een ja sekvensointi suoritettiin 2 x 100 bp:n parillisen pään lukemilla käyttäen NextSeq550-reagenssi v2 -sarjaa korkean tehon 300 syklillä. (NextSeq550-järjestelmän käyttöoppaan osa #15069765-V02 maaliskuu 2016, NextSeq550 Reagenssi V2 Kit Tehokas 300 sykliä Cat. nro FC-404-2004; Illumina, CA).