Physiopathologie de Clostridium et de l'entérocolite nécrosante néonatale : approches cliniques et moléculaires (CLOSNEC)

L'entérocolite nécrosante (ENC) demeure une cause importante de morbidité et de mortalité chez les nouveau-nés prématurés. Malgré de nombreuses investigations, sa pathogénie reste incertaine. Le rôle des bactéries intestinales dans le développement de la NEC est étayé par des preuves épidémiologiques (épidémies), l'isolement fréquent d'agents infectieux et une diminution de l'incidence de la NEC résultant d'un traitement antibiotique préventif. L'implication bactérienne serait due à la fermentation colique du lactose non hydrolysé, conséquence de l'immaturité intestinale des prématurés (déficit en lactase intestinale). À ce jour, aucune bactérie spécifique ou modèle de colonisation bactérienne n'a été associé de manière causale au développement de la NEC. Les signes cliniques et certaines études épidémiologiques sont compatibles avec l'implication des clostridies dans l'ECN. En effet, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens et Clostridium paraputrificum ont été isolés du sang, des matières fécales et des fluides péritonéaux de nouveau-nés prématurés souffrant de NEC. En outre, une corrélation entre la présence de C. butyricum et de C. paraputrificum et la pneumatose intestinale dans des échantillons de tissus de nouveau-nés NEC a été rapportée. De plus, le rôle de ces espèces de clostridia dans la pathogenèse de NEC a été démontré à l'aide de modèles animaux NEC (porcelet prématuré ou cailles gnotobiotiques). En particulier, les produits finaux de la fermentation du lactose (butyrate ou isobutyrate) ont été liés à l'apparition de lésions caecales de type NEC dans le modèle animal de cailles gnotobiotiques.

Ce projet s'inscrit dans ce contexte, et vise à confirmer l'implication clostridienne dans la pathogenèse des NEC et à rechercher des biomarqueurs de pathogénicité bactérienne. À cette fin, les chercheurs utiliseront à la fois des approches cliniques et expérimentales.

L'étude clinique profitera du précédent réseau du projet EPIFLORE (ANR 2012) pour constituer sur une période d'un an une large collection de cas avérés d'ECN. Pendant cette période, les nouveau-nés prématurés diagnostiqués comme cas NEC (Bell stade II ou III) de 20 unités néonatales françaises seront inclus et appariés à un groupe témoin de nouveau-nés non NEC. Les données anthropométriques, les données cliniques, les prises médicamenteuses et alimentaires seront recueillies de la naissance à la sortie de l'unité néonatale. L'analyse du microbiote des nouveau-nés prématurés NEC et non NEC sera réalisée à l'aide d'une culture et d'un pyroséquençage du gène ARNr 16S. Cette étude cas-témoin vise à obtenir la plus grande collection française de cas cliniques et microbiologiques documentés de NEC qui permettra d'atteindre des résultats significatifs sur les caractéristiques du microbiote des nouveau-nés NEC. De plus, il confirmera l'implication de bactéries spécifiques, à savoir les clostridies, qui seront proposées comme marqueur biologique à haut risque de développer une NEC.

L'approche expérimentale consistera en la construction de mutants d'isolats cliniques de C. butyricum, C. perfringens et C. paraputrificum altérés dans la production de butyrate à l'aide de l'outil d'inactivation de la mutagenèse dirigée Clostron récemment adapté aux clostridies. les chercheurs inactiveront le gène codant pour l'enzyme responsable de la production de butyrate. La pathogénicité des souches de type sauvage et mutantes sera réalisée dans le précédent modèle animal de caille gnotobiotique de NEC. Cela nous permettra de vérifier l'hypothèse de l'implication biologique des espèces de Clostridia dans la pathogenèse de la NEC par le métabolite du produit final de la fermentation. Ce travail sera complété par une caractérisation phénotypique et une analyse protéomique des souches cliniques liées au développement de NEC afin de rechercher un biomarqueur de la pathogénicité bactérienne. L'absence de consensus pour la prévention de l'ECN est en partie due à la méconnaissance de sa pathogénie. Ce projet apportera des informations importantes en termes de données cliniques et mécanistes. La recherche de marqueurs biologiques comme le proposent les chercheurs sera utile pour la pratique clinique et les stratégies de mise en œuvre de la prévention