Clostridium e enterocolite necrotizzante neonatale Fisiopatologia: approcci clinici e molecolari (CLOSNEC)

L'enterocolite necrotizzante (NEC) rimane un'importante causa di morbilità e mortalità tra i neonati prematuri. Nonostante molte indagini la sua patogenesi rimane poco chiara. Il ruolo dei batteri intestinali nello sviluppo di NEC è supportato da prove epidemiologiche (focolai), dal frequente isolamento di agenti infettivi e da una diminuzione dell'incidenza di NEC derivante dal trattamento antibiotico preventivo. Si ritiene che l'implicazione batterica sia dovuta alla fermentazione del colon del lattosio non idrolizzato, una conseguenza dell'immaturità intestinale dei neonati prematuri (deficit di lattasi intestinale). Ad oggi, nessun batterio specifico o modello di colonizzazione batterica è stato associato in modo causale allo sviluppo di NEC. I segni clinici e alcuni studi epidemiologici sono coerenti con il coinvolgimento dei clostridi nella NEC. Infatti, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens e Clostridium paraputrificum sono stati isolati dal sangue, dalle feci e dai fluidi peritoneali di neonati pretermine affetti da NEC. Inoltre, è stata segnalata una correlazione tra la presenza di C. butyricum e C. paraputrificum e pneumatosis intestinalis in campioni di tessuto di neonati NEC. Inoltre, il ruolo di queste specie di clostridi nella patogenesi NEC è stato dimostrato utilizzando modelli animali NEC (maialino pretermine o quaglie gnotobiotiche). In particolare, i prodotti finali della fermentazione del lattosio (butirrato o iso-butirrato) sono stati collegati all'insorgenza di lesioni cecali simili a NEC nel modello animale di quaglie gnotobiotiche.

Questo progetto si colloca in questo contesto e mira a confermare il coinvolgimento dei clostridi nella patogenesi delle NEC ea ricercare biomarcatori di patogenicità batterica. A tal fine, i ricercatori utilizzeranno approcci sia clinici che sperimentali.

Lo studio clinico coglierà l'opportunità della precedente rete di progetti EPIFLORE (ANR 2012) per costruire durante un periodo di un anno un'ampia raccolta di casi comprovati di NEC. Durante quel periodo, i neonati pretermine diagnosticati come casi NEC (stadio Bell II o III) da 20 unità neonatali francesi saranno inclusi e abbinati a un gruppo di controllo di neonati non NEC. I dati antropometrici, i dati clinici, l'assunzione di farmaci e alimenti saranno raccolti dalla nascita alla dimissione dell'unità neonatale. L'analisi del microbiota dei neonati pretermine NEC e non-NEC sarà eseguita utilizzando la coltura e il pirosequenziamento del gene 16S rRNA. Questo studio caso-controllo mira a ottenere la più grande raccolta francese di casi NEC documentati clinicamente e microbiologicamente che consentiranno di raggiungere risultati significativi sulle caratteristiche del microbiota dei neonati NEC. Inoltre, confermerà il coinvolgimento di batteri specifici, ad esempio i clostridi, che saranno proposti come marcatori biologici ad alto rischio di sviluppo di NEC.

L'approccio sperimentale consisterà nella costruzione di mutanti di isolati clinici di C.butyricum, C. perfringens e C. paraputrificum alterati nella produzione di butirrato utilizzando lo strumento di knock out della mutagenesi diretta di Clostron recentemente adattato ai clostridi. i ricercatori inattiveranno il gene che codifica l'enzima responsabile della produzione di butirrato. La patogenicità di ceppi wild type e mutanti sarà valutata in precedenti modelli animali di quaglia gnotobiotica di NEC. Questo ci permetterà di verificare l'ipotesi del coinvolgimento biologico delle specie di Clostridia nella patogenesi del NEC attraverso il metabolita del prodotto finale della fermentazione. Questo lavoro sarà completato da una caratterizzazione fenotipica e da un'analisi proteomica dei ceppi clinici legati allo sviluppo di NEC al fine di ricercare un biomarcatore di patogenicità batterica. L'assenza di consenso per la prevenzione della NEC è in parte dovuta alla mancanza di conoscenza della sua patogenesi. Questo progetto fornirà informazioni importanti in termini di dati clinici e meccanicistici. La ricerca di marcatori biologici come proposto dai ricercatori sarà utile per la pratica clinica e le strategie di attuazione della prevenzione