Test sierologici ad alto rendimento della piattaforma di anticorpi per coorti per adulti (DEVHISE)

Orthomyxoviridae, Flaviviridae e Coronaviridae sono famiglie virali da cui emergerà un agente pandemico/epidemico nei prossimi anni. In particolare, i virus dell'influenza aviaria altamente patogena del sottotipo H5N1 e MERS-CoV sono virus respiratori che sono noti per causare infezioni sporadiche nell'uomo in vaste aree del mondo in cui queste infezioni sono endemiche negli animali. Questi agenti patogeni sono nell'elenco ad alta priorità dell'Organizzazione mondiale della sanità, dato il loro potenziale per aumentare la propria forma fisica negli umani, la loro capacità di riassortare/ricombinare con altri agenti respiratori e il potenziale imprevedibile per acquisire capacità di trasmissione da uomo a umano. Zika e altri flavivirus zoonotici esotici come i virus Dengue, Usutu o Mayaro non sono agenti patogeni respiratori, ma le crescenti temperature associate ai cambiamenti climatici stanno rendendo la regione europea uno spazio ecologico più favorevole per l'introduzione e il mantenimento di questi virus.

Lo sviluppo di una piattaforma sierologica ad alto rendimento per lo screening di massa è un elemento fondamentale per aumentare la preparazione per gli scenari pandemici. Nel caso di grandi seresurvei di emergenza, l'innovazione nelle tecniche di campionamento è un aspetto spesso trascurato ma pertinente per facilitare l'iscrizione di soggetti nelle popolazioni sia adulte che pediatriche. La venipuntura è considerata il gold standard per il campionamento del sangue. Tuttavia, questo metodo include diversi importanti svantaggi: il grande volume che viene raccolto (superiore a 1 ml), la sua invasività, la necessità di un ambiente sterile e il personale specializzato per eseguirlo e il potenziale rischio di esposizione ai patogeni, il che richiede un grande sforzo nella preparazione del campione e nelle condizioni di spedizione (che influenza i costi) (revisione in Bossi et al. 2024).

Di conseguenza, a partire dal 1963 con macchie di sangue secco (DBS), sono stati proposti metodi di microsampionamento del sangue, ovvero la raccolta di piccoli volumi (≤150 μL) di sangue capillare derivato di solito attraverso una puntura delle dita. Il campionamento capillare è una procedura standard per i test di screening neonatale e i pazienti diabetici, mentre la venipuntura è l'approccio standard al campionamento del sangue e, in particolare, per quelli orientati allo screening degli anticorpi contro le malattie infettive. Le tecniche del dito e del tallone sono state raramente adottate per la titolazione di anticorpi neutralizzanti a causa del volume limitato di sieri disponibili e del processo di laboratorio ingombranti richiesto per recuperare gli anticorpi (cioè perforare DBS, eluire i punti durante la notte, ecc.).

I dispositivi di microsampling, noti come microsampling volumetrici (VTM), rappresentano un nuovo approccio al campionamento e all'auto-campionamento. Questi strumenti servono allo stesso scopo del DBS (cioè documenti di filtro), che è stato comunemente usato per l'ematologia neonatale, ma con il vantaggio della facilità di automazione e la standardizzazione dei volumi di campioni. Inoltre, VTM può essere particolarmente vantaggioso nei centri remoti non specializzati e nei contesti domestici in cui la venipuntura non è possibile e in cui gli impedimenti logistici sfidano la conservazione dei campioni.

VTM è un metodo che consente una corretta quantificazione del campione. L'ematocrito, insieme ad altri parametri, come l'umidità e le condizioni di essiccazione, influenzano la dimensione del punto, l'omogeneità spot e il recupero dell'estrazione degli analiti nei DBS, rendendolo inadeguato per le procedure che richiedono la quantificazione degli analiti (rivisto in Thangavelu et al. 2023). Inoltre, le proprietà della carta da filtro, una componente fondamentale di DBS, possono introdurre ulteriori distorsioni influenzando "la massima capacità di carico, diffusione del sangue, effetti cromatografici, stabilità dell'analita e recupero". (Recensione in Thangavelu et al. 2023).

Durante le emergenze epidemiche, i laboratori raramente soddisfano richieste ad alto volume per il rilevamento e la titolazione di anticorpi neutralizzanti a causa di vincoli tecnici e logistici. Pertanto, è necessario aumentare le capacità dei laboratori per soddisfare tali richieste. Nel caso di un hub per sondaggi sierologici, il ridimensionamento delle tecniche esistenti richiede sviluppi nel campo dell'automazione (cioè l'uso di workstations di gestione dei liquidi) e il passaggio da un test sierologico basato sulla piastra standard da 96 pozzetti a una tecnologia a 384 pozzetti. Lavorare con il formato 384 non solo soddisfa la necessità di un aumento della capacità, ma consente anche una riduzione del volume di lavoro minimo del campione. Tale riduzione dei volumi di lavoro sarebbe un elemento positivo per aumentare la sensibilità dei test eseguiti su campioni raccolti tramite VTM (cioè evitando le fasi di eluizione per soddisfare volumi di lavoro più elevati). Inoltre, i volumi più bassi di sangue implicano minimizzare l'angoscia associata a lunghe residenze dei pazienti pediatrici (cioè una goccia di sangue anziché due o tre).

Esiste un corpus limitato di letteratura sull'uso di VTM come alternativa al DBS per la raccolta di sangue capillare. VTM è stato principalmente paragonato ai campioni di siero ottenuti dalla venipuntura per quanto riguarda le prestazioni delle analisi di profilazione biochimica e metabolica emata. Solo uno studio ha confrontato le prestazioni di un test di neutralizzazione che mira agli anticorpi contro il virus sinciziale respiratorio (RSV) usando campioni ottenuti per venipuntura o con VTM, scoprendo che VTM era un dispositivo adeguato per raccogliere e conservare i campioni di sangue per i test di neutralizzazione virale (Terstappen et al., 2023).

Utilizzando un test di neutralizzazione del sistema di espressione lentivirale, Roper e coautori hanno dimostrato nel 2023 che DBS sulla carta da filtro ha fornito risultati simili ai sieri abbinati al paziente nella valutazione della presenza di anticorpi neutralizzanti contro la SARS-CoV-2. Tuttavia, sono stati osservati problemi di sensibilità in relazione alla variabilità della dimensione di taglio del sangue. Nel 2021, santilio e coautori si affidarono a un test di neutralizzazione del virus surrogato (SVNT) che quantificò l'inibizione dell'interazione tra SARS-COV-2 S e i campioni negativi e negativi di conversione dell'angiotensina umana e hanno dimostrato che le risposte in DBS da SARS-COV-2 PCR positive e campioni negativi avevano una correlazione enzimatica di 99% a coppie.

Tra i diversi metodi di microsampionamento del sangue, "il dispositivo MITRA, che comprende un campionatore di plastica attaccato a una punta proprietaria di polimero idrofilo basato sulla tecnologia del microsampionamento volumetico brevettato di mitra di Microsampling (VAMS®). I dispositivi Mitra sono compatibili con 96 Autoutori e sistemi automatizzati di gestione dei liquidi, rendendoli eccezionalmente indicati per metodi ad alto rendimento. Secondo Kok and Fillet's Review (2018), "[a] studio cross-laboratory ha dimostrato che la tecnologia VAMS consente la raccolta di un volume di sangue preciso e preciso indipendentemente dall'ematocrito". Come altri dispositivi di microsampionamento, Mitra Vams consente l'auto-campionamento ed è minimamente invasivo. Tuttavia, al di là di questi vantaggi, questi dispositivi ne hanno ulteriori: rispetto alla maggior parte degli altri dispositivi di microsampionamento, si possono raccogliere maggiori volumi di sangue; e, come notato sopra, sono eccezionalmente compatibili con i processi ad alto rendimento. Questi tratti li rendono notevoli candidati per la preparazione e la risposta pandemica. In effetti, i Mitra Vams sono stati usati per le procedure che mirano a rilevare e titolare gli anticorpi contro la SARS-COV-2 (ad esempio, Johnson et al. 2022; Whitcombe et al., 2020; Wang et al. 2020; Klumpp-Thomas et al. 2021).

Questo studio mira a svilupparsi in saggi di neutralizzazione ad alto rendimento da 384 formato IZSVE per virus respiratori emergenti e riemergenti con potenziale pandemico per aumentare la capacità di preparazione sia a livello regionale che nazionale. Questa piattaforma diagnostica includerà la convalida dei dispositivi Mitra VAMS per la raccolta di campioni di sangue per la procedura diagnostica.

Obiettivo primario: convalidare l'uso nella pratica diagnostica dei dispositivi di microsample (Mitra VAMS) per la rilevazione di anticorpi neutralizzanti per le malattie virali infettive della natura epidemica in uno scenario del mondo reale per le popolazioni adulte.

Obiettivo secondario: sviluppare una piattaforma sierologica ad alto rendimento per il rilevamento di anticorpi neutralizzanti contro i ceppi di influenza aviaria associati al potenziale pandemico (H5N1, H3N8, H9N2, ecc.), MERS-Cov e Zika.

Lo studio clinico sarà condotto come studio trasversale.

Questo studio sarà trasversale. Ci consentirà di valutare le prestazioni diagnostiche del test in un ambiente del mondo reale e di identificare potenziali variabili confondenti. Per convalidare il dispositivo di microsamplaggio, iscriveremo 62 pazienti adulti che saranno sottoposti a venipuntura per scopi diagnostici di routine o esami medici di routine da parte del medico professionale. Per questo motivo, le procedure di venipuntura non devono essere considerate un intervento. In questo studio, l'intervento consisterà solo nel campionamento capillare con una lancetta (cioè, puntura di dito). Questo confronto si concentrerà sulla titolazione di anticorpi contro virus endemici come l'influenza di tipo A (cioè, ceppi di influenza stagionale, come PDMH1N1 o H3N2) e SARS-CoV-2. Lo stesso test sierologico sarà sviluppato per titolare gli anticorpi neutralizzanti contro i patogeni emergenti come i virus dell'influenza aviaria dei sottotipi H3 e H5, il virus Zika e il MERS-CoV.

Lo studio fa parte del progetto VERDI (Valutazione delle varianti SARS-CoV2 in gravidanza e coediatrics Cohorts) finanziato dall'Unione Europea.