Nuovo Strumento Diagnostico (MinION) per l'Identificazione dei Microrganismi nelle Ferite del Piede di Pazienti Affetti da Osteomielite del Piede Diabetico (MINI-OS)

Il diabete mellito è una delle malattie più comuni al mondo. Tra le sue complicanze, il 34% dei pazienti affetti da diabete svilupperà ulcere del piede nel corso della vita. Una volta che questa lesione si è sviluppata a causa della triopatia (arteriopatia, neuropatia, immunopatia), oltre il 50% di queste ferite si infetterà, portando a gravi conseguenze: danni ossei (dal 60 all'80% dei casi), amputazione (20% delle ferite infette), mortalità (68% a 5 anni) e morbilità. I costi aggiuntivi associati a questa condizione superano gli 850 miliardi di dollari in tutto il mondo, con 1 milione di dollari spesi ogni 30 secondi a causa delle complicanze di queste ferite negli Stati Uniti. Le ulcere del piede diabetico (DFU) sono quindi un importante problema di salute pubblica.

Per gli specialisti in malattie infettive, una delle principali difficoltà nel trattare le infezioni in queste ferite è distinguere tra colonizzazione batterica - un processo fisiologico, e infezione - un processo patologico. Gli studi sul microbiota delle ferite del piede nei pazienti diabetici mostrano la natura polimicrobica di queste lesioni, che contengono batteri commensali del microbiota cutaneo, batteri patogeni opportunisti e batteri dell'ambiente. Tra i cocchi Gram-positivi, Staphylococcus aureus è la specie più spesso identificata nell'osteomielite del piede diabetico (DFO) (23,4%), seguita da Pseudomonas spp. (11,1%), Escherichia coli (11,5%), Proteus spp. (8,3%), Klebsiella spp. (6,9%) ed Enterococcus spp. (5,4%). Gli stafilococchi coagulasi-negativi, sebbene coinvolti in meno del 4% delle infezioni, spesso rimangono difficili da identificare con la spettrometria di massa a livello di specie, anche se alcuni di essi sono noti per la loro patogenicità. L'altra grande difficoltà è il tempo necessario per ottenere i risultati quando si sospetta un'osteomielite. In tali situazioni, ottenere un campione osseo è il metodo standard e il modo migliore per identificare il/i patogeno/i responsabile/i e la loro sensibilità agli antibiotici. La biopsia ossea può essere eseguita intraoperatoriamente o percutaneamente, come raccomandato dall'International Working Group of the Diabetic Foot (IWGDF) nel 2023. Inoltre, per evitare colture falsamente negative, gli esperti suggeriscono di ritardare la biopsia ossea nei pazienti già in terapia antibiotica, idealmente per almeno due settimane. Nel laboratorio di microbiologia, la diagnosi standard basata sulla coltura microbiologica convenzionale può richiedere fino a due settimane per identificare i batteri causali ed eseguire i test di sensibilità agli antibiotici sul/i patogeno/i responsabile/i, portando il tempo totale per stabilire una diagnosi a 4 settimane. Per ridurre questo ritardo, alcune tecniche di microbiologia molecolare senza coltura, in particolare il sequenziamento di nuova generazione metagenomico (mNGS), hanno dimostrato che il microbiota della maggior parte delle infezioni delle ferite è più diversificato e abbondante di quello rivelato dai metodi di coltura convenzionali. Tuttavia, sono disponibili pochissimi dati metagenomici sulle biopsie ossee da DFOM. Poiché gli strumenti di biologia molecolare non erano in grado di distinguere tra cellule batteriche vive e morte e non possono identificare i generi batterici che contribuiscono allo stato clinico dell'infezione, il loro uso nella pratica quotidiana non è raccomandato dall'IWGDF e dalla SPILF (Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française), poiché i loro risultati potrebbero portare all'uso non necessario di antibiotici ad ampio spettro. Studi recenti basati sull'analisi metagenomica di biopsie ossee, biopsie di tessuti molli e tamponi di ferite del piede in pazienti diabetici hanno identificato la diversità microbica come un marker di infezione. Il numero di batteri coinvolti in casi confermati di infezione è stimato in oltre 70, una cifra difficile da raggiungere con i metodi di routine convenzionali. L'uso della PCR basata sull'amplificazione del gene che codifica per l'rRNA 16S è considerato inadatto a causa della frequente natura polimicrobica dei campioni di DFOM. I metodi di PCR multiplex non sono esaustivi nell'identificazione di tutti i patogeni. Infine, i metodi di coltura convenzionali sono spesso lunghi, e l'identificazione delle specie utilizzando metodi di laboratorio come la spettrometria di massa MALDI-TOF è spesso fonte di confusione o fallimento. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo strumento di sequenziamento rapido: il MinION. È piccolo e veloce e può sequenziare un genoma batterico o virale da campioni a singolo microbo in meno di quattro ore, o determinare un pannello di microrganismi presenti in un campione più complesso. Questo strumento è particolarmente utile per il liquido cerebrospinale.