Nowe narzędzie diagnostyczne (MinION) do identyfikacji mikroorganizmów w ranach stóp u pacjentów żyjących z cukrzycową osteomielitą stopy (MINI-OS)

Cukrzyca jest jedną z najczęstszych chorób na świecie. Spośród jej powikłań, 34% pacjentów żyjących z cukrzycą rozwinie w ciągu swojego życia owrzodzenia stóp. Po rozwinięciu się tej zmiany z powodu triopatii (arteriopatii, neuropatii, immunopatii), ponad 50% tych ran ulegnie zakażeniu, prowadząc do poważnych konsekwencji: uszkodzenia kości (60 do 80% przypadków), amputacji (20% zainfekowanych ran), śmiertelności (68% w ciągu 5 lat) i zachorowalności. Dodatkowe koszty związane z tym schorzeniem przekraczają 850 miliardów dolarów na całym świecie, z czego 1 milion dolarów wydawany jest co 30 sekund z powodu powikłań tych ran w USA. Owrzodzenia stóp cukrzycowych (DFU) są zatem poważnym problemem zdrowia publicznego.

Dla specjalistów chorób zakaźnych jedną z głównych trudności w leczeniu infekcji tych ran jest rozróżnienie między kolonizacją bakteryjną – procesem fizjologicznym, a infekcją – procesem patologicznym. Badania mikrobioty ran stóp u pacjentów z cukrzycą pokazują polimikrobowy charakter tych zmian, które zawierają komensalne bakterie z mikrobioty skóry, oportunistyczne bakterie chorobotwórcze i bakterie ze środowiska. Spośród Gram-dodatnich ziarniaków, Staphylococcus aureus jest gatunkiem najczęściej identyfikowanym w cukrzycowym zapaleniu kości stopy (DFO) (23,4%), a następnie Pseudomonas spp. (11,1%), Escherichia coli (11,5%), Proteus spp. (8,3%), Klebsiella spp. (6,9%) i Enterococcus spp. (5,4%). Gronkowce koagulazoujemne, choć zaangażowane w mniej niż 4% infekcji, często pozostają trudne do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas na poziomie gatunku, mimo że niektóre z nich są znane ze swojej patogenności. Drugą główną trudnością jest czas potrzebny do uzyskania wyników, gdy podejrzewa się zapalenie kości i szpiku. W takich sytuacjach pobranie próbki kości jest standardową metodą i najlepszym sposobem na identyfikację odpowiedzialnych patogenów oraz ich wrażliwości na antybiotyki. Biopsję kości można wykonać śródoperacyjnie lub przezskórnie, zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Grupy Roboczej ds. Stopy Cukrzycowej (IWGDF) w 2023 roku. Ponadto, aby uniknąć fałszywie ujemnych hodowli, eksperci sugerują opóźnienie biopsji kości u pacjentów już przyjmujących antybiotyki, najlepiej na co najmniej dwa tygodnie. W laboratorium mikrobiologicznym standardowa diagnoza oparta na konwencjonalnej hodowli mikrobiologicznej może zająć do dwóch tygodni, aby zidentyfikować bakterie sprawcze i przeprowadzić testy wrażliwości na antybiotyki odpowiedzialnych patogenów, co daje całkowity czas na ustalenie diagnozy do 4 tygodni. Aby skrócić to opóźnienie, niektóre techniki mikrobiologii molekularnej bez hodowli, w szczególności metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS), wykazały, że mikrobiota większości infekcji ran jest bardziej zróżnicowana i obfita niż ta ujawniona przez konwencjonalne metody hodowli. Jednak dostępnych jest bardzo niewiele danych metagenomicznych dotyczących biopsji kości z DFOM. Ponieważ narzędzia biologii molekularnej nie były w stanie odróżnić żywych i martwych komórek bakteryjnych oraz nie mogą zidentyfikować rodzajów bakterii przyczyniających się do stanu klinicznego infekcji, ich stosowanie w codziennej praktyce nie jest zalecane przez IWGDF i SPILF (Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française), ponieważ ich wyniki mogą prowadzić do niepotrzebnego stosowania antybiotyków o szerokim spektrum działania. Ostatnie badania oparte na analizie metagenomicznej biopsji kości, biopsji tkanek miękkich i wymazów z ran stóp u pacjentów z cukrzycą zidentyfikowały różnorodność mikrobiologiczną jako marker infekcji. Liczba bakterii zaangażowanych w potwierdzone przypadki infekcji szacowana jest na ponad 70, liczbę trudną do osiągnięcia za pomocą konwencjonalnych rutynowych metod. Stosowanie PCR opartego na amplifikacji genu kodującego 16S rRNA uważa się za nieodpowiednie ze względu na częsty polimikrobowy charakter próbek DFOM. Metody multiplex PCR nie są wyczerpujące w identyfikacji wszystkich patogenów. Wreszcie, konwencjonalne metody hodowli są często czasochłonne, a identyfikacja gatunków za pomocą metod laboratoryjnych, takich jak spektrometria mas MALDI-TOF, często jest źródłem zamieszania lub niepowodzenia. Ostatnio opracowano nowe narzędzie szybkiego sekwencjonowania: MinION. Jest mały i szybki, może zsekwencjonować genom bakteryjny lub wirusowy z próbek pojedynczych mikroorganizmów w mniej niż cztery godziny lub określić zestaw mikroorganizmów obecnych w bardziej złożonej próbce. To narzędzie jest szczególnie przydatne do badania płynu mózgowo-rdzeniowego.