地域住民の高齢者に対する監視付き運動トレーニングの効果

設計 三次医療病院の治験審査委員会は、この研究を承認しました (IRB 番号: 201602058A3C502 および NCT04839796)。 高齢者に対する運動療法の効果について、評価者と被験者を盲検化したランダム化対照試験が2021年5月から11月まで実施された。 すべての被験者は、実験手順を理解した上でインフォームドコンセントを提供しました。 その後、参加者は、コンピューターで生成された非表示の割り当てスケジュールを使用して、病院または自宅運動トレーニング (HET) グループで、中強度の継続トレーニング (MICT) で 30 分間の監視付き運動トレーニング (SET) を 24 セッション受けるようにランダムに割り当てられました。 データは、無作為化の前と運動トレーニングの完了後に、盲検評価者によって収集されました。

参加者 地域病院に隣接して住んでいる、55 歳以上の地域在住者が調査されました。 ミニ精神状態検査（MMSE）スコアが 24 以上で、腰椎陰性および下肢の変性関節障害を持つ高齢者が対象となりました。 私たちの以前の研究で言及された不安定な臨床症状を示した人、またはサルコペニアに関するアジア作業部会の推奨に基づいて診断されたサルコペニアを患った人は、この研究の候補者ではありませんでした。 また、米国スポーツ医学会（ACSM）が示唆する有酸素運動の絶対的禁忌を持つ個人も除外しました。 Medical Outcomes Study Short Form 36 (SF-36) のベースラインの身体的コンポーネント スコア (PCS) と精神的コンポーネント スコア (MCS) は、生活の質 (QoL) を評価するために使用され、採用から 24 週間後に再評価されました。 対象となった参加者のベースラインの人口統計的特徴と臨床情報が注意深く記録されました。

運動トレーニング すべての被験者には、スマート ウォッチ (WDI08、WisDat Inc.、台湾、台中) を装着し、1 日あたり少なくとも 8000 歩 (stp/d) 歩くように指示されました。 SET参加者は、1日あたり8000stpに加え、当院の自転車エルゴメーター（Ergoselect 150P、ergoline GmbH、ビッツ、ドイツ）を使用して30分間、監視付きMICT（最大予測心拍数の70％）を8分間、24セッション受けました。 -週間の期間。 すべての被験者は、電話とアプリによる募集後の最初の 8 週間は毎週 8,000 stp/日以上の摂取をするよう促されました。 MICT 完了後、SET 参加者はさらに 16 週間 1 日あたり 8,000 stp 以上を摂取するよう指示されました。 HET 参加者は、24 週間の追跡期間にわたって 1 日あたり 8,000 stp を摂取するように指示されました。 後半の 16 週間では、すべての被験者に 8000 stp/日以上の摂取の指示が思い出されるわけではありませんでした。 ACSMガイドラインに従って、運動中に被験者に症状/兆候が現れた場合、運動トレーニングは終了されました。20 体力測定 手首に装着するスマートウォッチ（WDI08、Wisdat Inc.、台中、台湾）により、各被験者の毎日の歩数とエネルギー消費量、および1日あたりの平均歩数とエネルギー消費量（Kcal）を記録しました。 1 週間は、24 週間の追跡期間中の地域社会での 1 週間の毎日の平均歩数とエネルギー消費量を表します。

ふくらはぎ周囲（Calf_circ）は、両側脚の最大の Calf_circ を平均することによって得られました。 インタラクティブ音声と 3D 深度画像ガイドを使用したインテリジェント動作分析 (eFitHealth、uCare Medical Electronics, Co. Ltd.、台湾苗栗市) -到達距離 (補足データ 1)。 上記の各テストは、それぞれ VO2max (eV O2max)、下肢の筋力、および柔軟性を推定するために使用されました。21 体内総水分（TBW）、ミネラル分、タンパク質量（Prot）、除脂肪体重（LBM）、骨格筋量（SKM）、体脂肪量（BFM）、基礎代謝率（BMR）を含む体組成を測定しました。多重周波数生体インピーダンス分析（Inbody 720、Inbody Co., Ltd.、カリフォルニア州、米国）による。 上記の測定値は、最初の訪問前、8週間後、24週間後に記録されました。

ＲＮＡ抽出 募集時、最初の訪問から８週間後、および２４週間後に各被験者から１０ｍｌの全血を採血し、３．２％クエン酸ナトリウムを含むチューブに入れた。 次いで、サンプルを360×gで15分間遠心分離し、その上清を室温25℃で2400×gで20分間さらに遠心分離して、血漿血小板数を2.5×10^8/ml未満に維持した。 ４００μＬの処理済み血漿を２ｍＬのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｏｒｐ． ハンブルク、ドイツ）1200 μL の TRIzol（ThermoFisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）および 5 μL の miR-39（5x10^-15 mol/μL）、C. エレガンスの外因性対照、および 2 μg と混合します。 (血漿中 10 μg/mL) 酵母 RNA (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を室温で 15 分間反応させます。 さらに320μLのクロロホルムを加え、室温に5分間置いた。 標本を4℃、12000×gで15分間遠心分離し、300μLの無色の液体層を吸引して900μLの氷冷100％エタノールと-80℃で一晩混合した。 調製した標本を Direct-zol カラム (Direct-zol RNA Miniprep、Zymo Research corp.、米国カリフォルニア州アーバイン) に入れ、12000 xg で 30 秒間遠心分離しました。 次いで、カラムを新しい収集チューブに移し、400μLのRNA洗浄緩衝液と混合した後、12000×gで30秒間遠心分離した。 RNA洗浄緩衝液を廃棄した後、80μLのDNase I反応混合物(DNase I酵素5μL+DNA消化緩衝液75μL)をチューブに添加し、室温で15分間インキュベートした。 追加の 400 μL 前洗浄バッファーをチューブに導入し、12000 xg で 30 秒間遠心分離しました。 次いで、カラムを新しい１．５ｍＬのＲＮａｓｅフリーチューブに移し、８０μＬのヌクレアーゼフリー水で室温で２分間処理した。 調製したサンプルを12000×gで2分間遠心分離し、RNA溶液を溶出させた。

上記の３つの異なる時点における血漿マイクロＲＮＡレベルのｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－２２２レベルの定量化を分析した。 RT-qPCR システム (T100TM サーマル サイクラー、Bio-Rad Laboratories Inc.、バークレー、カリフォルニア州、米国) を使用してワンステップ リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) を実行し、血漿マイクロ RNA レベルを評価しました。 100 ng のトータル RNA 抽出液、10 μL の TaqMan マスター ミックス (ThermoFisher)、5.8 μL のヌクレアーゼフリー水、0.2 μL のユニバーサル プローブ ライブラリー 21 (10 μM)、0.1 μL の RNase インヒビター、自己構築された 1 μL のフォワード プライマー、および 1 miR-39、miR-126、miR-146a の microL リバースプライマー、および 2 microL cDNA テンプレートを氷上で作成しました。 全ての反応物を48ウェルプレート内で95℃で3分間インキュベートした後、95℃で5秒間、60℃で10秒間、および72℃で1秒間を40サイクル行った。 外因性コントロールとしてのプライマリ C. エレガンス miR-39 (C-miR-39) の自己構築されたフォワードおよびリバース プライマー配列。 ヒト miR-126 (miR-126) および miR-146a (miR-146a) (補足表 1) は外因性対照によって正規化され、追跡中のマイクロ RNA レベルの発現を決定するために使用されました。

miRCURY LNA SYBR Green PCR キット (Qiagen) を使用して、ヒト miR-21 (miR-21) および miR-222 (miR-222) を測定しました。 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer 4 μL、10X miRCURY RT Wnzyme Mix 2 μL、およびヌクレアーゼフリー水中の 100 ng total RNA 抽出液 14 μL の混合物を、48 ウェルプレート内で 42°C で 60 分間インキュベートし、続いて95℃でcDNAを生成します。 Qiagen から購入した 2 μL の C-miR-39 (または miR-21/ または miR-222) プライマー、10 μL の miRCURY SYBR Green Master Mix、2 μL のヌクレアーゼフリー水、および 6 μL の 5X 生成 cDNA テンプレートを含む混合物を、 95℃で2分間、その後95℃で10秒間と56℃で60秒間を40サイクル。 has-miR-21 および hsa-miR-222 は C-miR-39 によって正規化され、追跡調査中のマイクロ RNA レベルの発現を決定するために使用されました。

炎症活性の測定 300 μL の血清を 1:2 の比率で希釈しました。 ウェルあたり 50 μL の調製サンプルとキャリブレーターを 2 つずつアッセイプレート (Multiplex Human Cytokine Pannel 1、Boster Biological Technology、プレザントン、カリフォルニア州、米国) にロードしました。 抗体を含む各ウェルは、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、および TNFα を捕捉しました。 ビオチン化分析物特異的抗体を含む混合物は、結合していないタンパク質を洗い流した後に添加されます。 ビオチン化抗体により、特定のアレイ分析物のそれぞれに対するサンドイッチが完成しました。 未結合のビオチン化抗体を洗い流した後、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ (SHRP) を添加します。 追加の洗浄後、アレイの各位置に残る SHRP の量は、最初に捕捉された上記のサイトカインの量に比例します。 アレイの各位置上の結合酵素の量は、化学発光基質の添加により測定されます。

統計分析 データは平均値 (95% CI) または n (%) として表示されます。 連続パラメータと名目パラメータの差、および 2 つのグループ間の差異は、それぞれスチューデント t 検定とカイ二乗検定によって推定されました。 反復測定 ANOVA を実行して、各グループの 3 つの時点で測定された連続パラメータの差を分析しました。 ピアソン相関を実行して、体力と miRNA の関係を調べました。 0.05 未満の p 値を統計的有意性とみなしました。