Effetti dell'esercizio fisico supervisionato sugli abitanti della comunità più anziani

Disegno L'Institutional Review Board di un ospedale terziario ha approvato lo studio (IRB n.: 201602058A3C502 e NCT04839796). Da maggio a novembre 2021 è stato condotto uno studio controllato randomizzato con valutatore e soggetto in cieco per gli effetti dei regimi di esercizio sulle persone anziane. Tutti i soggetti hanno fornito il consenso informato dopo aver compreso le procedure sperimentali. I partecipanti sono stati quindi assegnati in modo casuale a sottoporsi a 30 minuti di allenamento fisico supervisionato (SET) a un allenamento continuo di intensità moderata (MICT) per 24 sessioni in ospedale o gruppi di allenamento a casa (HET) utilizzando un programma di assegnazione nascosto generato dal computer. I dati sono stati raccolti da un valutatore in cieco prima della randomizzazione e dopo aver completato l'esercizio fisico.

Partecipanti Sono stati intervistati individui residenti in comunità con età >=55 anni, che vivevano in prossimità di un ospedale comunitario. Sono stati reclutati adulti anziani con punteggio MMSE (Mini-Mental State Examination) > 24 e colonna lombare negativa, nonché disturbo degenerativo delle articolazioni degli arti inferiori. Coloro che avevano presentazioni cliniche instabili menzionate nei nostri studi precedenti, o sarcopenia, diagnosticata sulla base della raccomandazione dell'Asian Working Group for Sarcopenia, non erano candidati allo studio. Abbiamo anche escluso le persone con controindicazioni assolute per le attività aerobiche, suggerite dall'American College of Sports Medicine (ACSM). Il punteggio basale della componente fisica (PCS) e il punteggio della componente mentale (MCS) nel Medical Outcomes Study Short Form 36 (SF-36) sono stati utilizzati per valutare la qualità della vita (QoL) e sono stati rivalutati 24 settimane dopo il reclutamento. Le caratteristiche demografiche di base e le informazioni cliniche dei partecipanti inclusi sono state accuratamente registrate.

Esercizio fisico A tutti i soggetti è stato chiesto di indossare uno smartwatch (WDI08, WisDat Inc., Taichung, Taiwan) e di fare almeno 8000 passi al giorno (stp/d). Oltre a 8000 stp/d, i partecipanti al SET sono stati sottoposti a 24 sessioni di MICT supervisionato (70% della frequenza cardiaca massima prevista) per 30 minuti su un cicloergometro (Ergoselect 150P, ergoline GmbH, Bitz, Germania) nel nostro ospedale durante un periodo di 8 periodo di una settimana. A tutti i soggetti è stato ricordato di assumere >=8000 stp/d ogni settimana durante le prime 8 settimane dopo il reclutamento tramite telefonata e app. Dopo aver completato il MICT, ai partecipanti SET è stato chiesto di assumere >=8000 stp/d per altre 16 settimane. Ai partecipanti HET è stato chiesto di assumere 8000 stp/die durante il periodo di follow-up di 24 settimane. Durante le ultime 16 settimane, l'istruzione di assumere>=8000 stp/d non è stata ricordata a tutti i soggetti. L'esercizio fisico è stato interrotto quando il soggetto presentava sintomi/segni durante l'esercizio secondo le linee guida ACSM.20 Misurazione della forma fisica Lo smartwatch da polso (WDI08, Wisdat Inc., Taichung, Taiwan) ha registrato il numero di passi giornalieri e il dispendio energetico in ogni soggetto, e il numero medio di passi e il dispendio energetico (Kcal) al giorno in una settimana rappresentava i passi giornalieri medi e il dispendio energetico di una settimana in comunità durante il periodo di follow-up di 24 settimane.

La circonferenza del polpaccio (Calf_circ) è stata ottenuta calcolando la media del più grande Calf_circ nelle gambe bilaterali. Analisi intelligente del movimento (eFitHealth, uCare Medical Electronics, Co. Ltd., Miaoli, Taiwan) utilizzando voci interattive e guide di immagini di profondità 3D per valutare il numero di passi di 2 minuti, la durata della posizione seduta-eretta di 5 volte e la posizione seduta-eretta sulla sedia -raggiungere la distanza (dati supplementari 1). Ciascuno dei test di cui sopra è stato utilizzato per stimare rispettivamente il VO2max (eV O2max), la forza muscolare degli arti inferiori e la flessibilità.21 Sono stati misurati la composizione corporea, inclusa l'acqua corporea totale (TBW), la porzione minerale, la quantità di proteine ​​(Prot), la massa corporea magra (LBM), la massa muscolare scheletrica (SKM), la massa grassa corporea (BFM) e il metabolismo basale (BMR) mediante analisi di bioimpedenza a frequenza multipla (Inbody 720, Inbody Co., Ltd., CA, USA). Le misurazioni di cui sopra sono state documentate prima, 8 settimane dopo e 24 settimane dopo la visita iniziale.

Estrazione dell'RNA Il prelievo di sangue di 10 ml di sangue intero da ciascun soggetto al reclutamento, a 8 settimane ea 24 settimane dalla visita iniziale è stato posto in una provetta contenente il 3,2% di citrato di sodio. I campioni sono stati quindi centrifugati a 360xg per 15 minuti, il cui supernatante è stato ulteriormente centrifugato a 2400xg per 20 minuti a temperatura ambiente di 25 ℃ per mantenere la conta piastrinica inferiore a 2,5×10^8/ml. Il plasma trattato di 400 microL è stato posto in un eppendorf da 2 ml (Eppendorf corp. Amburgo, Germania) da miscelare con 1200 microL di TRIzol (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) e 5 microL di miR-39 (5x10^-15 mol/microL), controllo esogeno, di C. elegans e 2 microg (10 microg/mL nel plasma) RNA di lievito (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) per 15 minuti a temperatura ambiente. Sono stati aggiunti altri 320 microL di cloroformio e posti a temperatura ambiente per 5 minuti. Il campione è stato centrifugato a 12000 xg per 15 minuti a 4 ℃ e 300 microL di strato fluido incolore sono stati aspirati per miscelare con 900 microL di etanolo ghiacciato al 100% durante la notte a -80 ℃. Il campione preparato è stato posto nella colonna Direct-zol (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research corp., Irvine, CA, USA) ed è stato quindi centrifugato a 12000 xg per 30 sec. La colonna è stata quindi trasferita in una nuova provetta di raccolta ed è stata centrifugata a 12000 xg per 30 secondi dopo la miscelazione con 400 microL di tampone di lavaggio dell'RNA. La miscela di reazione DNasi I di 80 microL (enzima DNasi I 5 microL + tampone di digestione del DNA 75 microL) è stata aggiunta alla provetta dopo aver scartato il tampone di lavaggio dell'RNA ed è stata incubata a temperatura ambiente per 15 minuti. Nella provetta è stato introdotto ulteriore tampone di prelavaggio da 400 microL ed è stato centrifugato a 12000 xg per 30 sec. La colonna è stata quindi trasferita in una nuova provetta priva di RNasi da 1,5 mL ed è stata trattata con 80 microL di acqua priva di nucleasi a temperatura ambiente per 2 minuti. Il campione preparato è stato centrifugato a 12000 xg per 2 minuti per eluire la soluzione di RNA.

È stata analizzata la quantificazione dei livelli di microRNA plasmatici di miR-21, miR-126, miR-146a e miR-222 nei tre diversi momenti precedenti. La reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale in una fase (RT-qPCR) è stata eseguita utilizzando un sistema RT-qPCR (T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA) per valutare i livelli di microRNA nel plasma. Una miscela di 100 ng di estrazione totale di RNA, 10 microL di TaqMan master mix (ThermoFisher), 5,8 microL di acqua priva di nucleasi, 0,2 microL di libreria di sonde universali 21 (10 microM), 0,1 microL di inibitore della RNasi, 1 microL di forward primer autocostruiti e 1 Sul ghiaccio sono stati creati primer inversi microL per miR-39, miR-126 e miR-146a e 2 microL cDNA template. Tutte le reazioni sono state incubate in una piastra a 48 pozzetti a 95°C per 3 minuti, seguiti da 40 cicli di 95°C per 5 secondi, 60°C per 10 secondi e 72°C per 1 secondo. Sequenze di primer forward e reverse autocostruite per C. elegans primario miR-39 (C-miR-39) come controllo esogeno. Il miR-126 umano (miR-126) e il miR-146a (miR-146a) (tabella supplementare 1) sono stati normalizzati dal controllo esogeno e sono stati utilizzati per determinare le espressioni dei livelli di microRNA durante il follow-up.

Il kit miRCURY LNA SYBR Green PCR (Qiagen) è stato utilizzato per determinare miR-21 (miR-21) e miR-222 (miR-222) umani. Una miscela di 4 microL 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer, 2 microL 10X miRCURY RT Wnzyme Mix e 14 microL di 100 ng di estrazione totale di RNA in acqua priva di nucleasi è stata incubata in una piastra da 48 pozzetti a 42°C per 60 minuti e seguito da 95°C per generare cDNA. Una miscela contenente 2 microL di primer C-miR-39 (o miR-21/ o miR-222) acquistati da Qiagen, 10 microL di miRCURY SYBR Green Master Mix, 2 microL di acqua priva di nucleasi e 6 microL di stampo di cDNA generato da 5X è stata incubata a 95°C per 2 min, seguiti da 40 cicli di 95°C per 10 sec e 56°C per 60 sec. has-miR-21 e hsa-miR-222 sono stati normalizzati dal C-miR-39 e sono stati utilizzati per determinare le espressioni dei livelli di microRNA durante il follow-up.

Determinazione dell'attività infiammatoria 300 microL di siero sono stati diluiti in rapporto 1:2. Caricato 50 microL di campioni preparati per pozzetto e calibratori in duplicato sulla piastra del test (Multiplex Human Cytokine Panel 1, Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Ciascun pozzetto contenente anticorpi ha catturato IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNFα. Una miscela che contiene anticorpi specifici per l'analita biotinilato viene aggiunta dopo aver lavato via qualsiasi proteina non legata. Gli anticorpi biotinilati hanno completato il sandwich per ogni specifico analita schierato. Dopo aver lavato via l'anticorpo biotinilato non legato, viene aggiunta streptavidina perossidasi di rafano (SHRP). Dopo un ulteriore lavaggio, la quantità di SHRP rimanente in ciascuna posizione dell'array è proporzionale alla quantità delle suddette citochine inizialmente catturate. La quantità di enzima coniugato su ciascuna posizione dell'array viene misurata con l'aggiunta di un substrato chemiluminescente.

Analisi statistica I dati sono presentati come media (IC 95%) o n (%). Le differenze dei parametri continui e nominali e tra i due gruppi sono state stimate rispettivamente dai test student-t e chi-quadrato. L'ANOVA a misurazione ripetuta è stata condotta per analizzare le differenze dei parametri continui misurati nei tre punti temporali in ciascun gruppo. La correlazione di Pearson è stata eseguita per trovare la relazione tra forma fisica e miRNA. Un valore p inferiore a 0,05 è stato considerato come significatività statistica.