Overvåket treningseffekt på eldre innbyggere

Design The Institutional Review Board ved et tertiærsykehus godkjente studien (IRB-nr.: 201602058A3C502 og NCT04839796). En randomisert kontrollert studie med bedømmer og blindet studie for effekter av treningsregimer på aldrende personer ble utført fra mai til november 2021. Alle forsøkspersoner ga informert samtykke etter å ha forstått de eksperimentelle prosedyrene. Deltakerne ble deretter tilfeldig allokert til å gjennomgå 30 minutter med overvåket treningstrening (SET) ved moderat intensitet kontinuerlig trening (MICT) i 24 økter i sykehus- eller hjemmetreningsgruppene (HET) ved bruk av en datamaskingenerert, skjult tildelingsplan. Data ble samlet inn av en blindet bedømmer før randomisering og etter fullført treningstrening.

Deltakere Samfunnsboende individer med alder>=55 år, som bodde ved siden av et fellessykehus, ble undersøkt. Eldre voksne med mini-mental state examination (MMSE) skår > 24 og negativ korsrygg samt degenerativ leddlidelse i nedre ekstremiteter ble rekruttert. De som hadde ustabile kliniske presentasjoner nevnt i våre tidligere studier, eller sarkopeni, diagnostisert basert på anbefaling fra Asian Working Group for Sarcopenia, var ikke kandidater til studien. Vi ekskluderte også personer med absolutte kontraindikasjoner for aerobe aktiviteter, foreslått av American College of Sports Medicine (ACSM). Baseline fysiske komponentskåre (PCS) og mentale komponentskårer (MCS) i Medical Outcomes Study Short Form 36 (SF-36) ble brukt til å vurdere livskvaliteten (QoL) og ble re-evaluert 24 uker etter rekrutteringen. Baseline demografiske egenskaper og klinisk informasjon om inkluderte deltakere ble nøye registrert.

Treningstrening Alle forsøkspersoner ble instruert til å bruke en smartklokke (WDI08, WisDat Inc., Taichung, Taiwan) og å ta minst 8000 skritt per dag (stp/d). I tillegg til 8000 stp/d, gjennomgikk SET-deltakerne 24 økter med overvåket MICT (70 % av maksimal predikert HR) i 30 minutter på et sykkelergometer (Ergoselect 150P, ergoline GmbH, Bitz, Tyskland) på sykehuset vårt i løpet av en 8. -uke periode. Alle forsøkspersoner ble påminnet om å ta >=8000 stp/d hver uke i løpet av de første 8 ukene etter rekruttering via telefon og app. Etter å ha fullført MICT ble SET-deltakerne instruert om å ta >=8000 stp/d i ytterligere 16 uker. HET-deltakere ble bedt om å ta 8000 stp/d over den 24 uker lange oppfølgingsperioden. I løpet av de siste 16 ukene ble instruksjonen om å ta >=8000 stp/d ikke påminnet i alle forsøkspersoner. Treningstreningen ble avsluttet når forsøkspersonen hadde symptomer/tegn under trening i henhold til ACSM-retningslinjen.20 Måling av fysisk form Den håndleddsbårne smartklokken (WDI08, Wisdat Inc., Taichung, Taiwan) registrerte antall skritt hver dag og energiforbruk i hvert fag, og gjennomsnittlig antall skritt og energiforbruk (Kcal) per dag i en uke representerte gjennomsnittlig daglige skritt og energiforbruk for en uke i samfunnet i løpet av den 24 uker lange oppfølgingsperioden.

Leggomkretsen (Calf_circ) ble oppnådd ved å beregne gjennomsnittet av den største Calf_circ i bilaterale ben. Intelligent bevegelsesanalyse (eFitHealth, uCare Medical Electronics, Co. Ltd., Miaoli, Taiwan) ved hjelp av interaktive stemmer og 3D-dybdebildeguider for å vurdere 2-minutters trinntall, 5-gangers sitte-til-stå-varighet, og stol-sitting -rekkevidde (tilleggsdata 1). Hver av testene ovenfor ble brukt til å estimere henholdsvis VO2max (eV O2max), muskelstyrke i nedre ekstremiteter og fleksibilitet.21 Kroppssammensetning, inkludert total kroppsvann (TBW), mineralandel, proteinmengde (Prot), mager kroppsmasse (LBM), skjelettmuskelmasse (SKM), kroppsfettmasse (BFM) og basal metabolsk rate (BMR) ble målt ved bioimpedansanalyse med flere frekvenser (Inbody 720, Inbody Co., Ltd., CA, USA). Målingene ovenfor ble dokumentert før, 8 uker etter og 24 uker etter første besøk.

RNA-ekstraksjon Blodprøvetaking av 10 ml fullblod fra hvert individ ved rekruttering, 8 uker og 24 uker fra det første besøket ble plassert i et rør som inneholdt 3,2 % natriumsitrat. Prøver ble deretter sentrifugert ved 360xg i 15 minutter, hvilken supernatant ble videre sentrifugert ved 2400xg i 20 minutter ved romtemperatur på 25 ℃ for å holde plasmablodplatetall mindre enn 2,5x10^8/ml. Behandlet plasma på 400 mikroL ble plassert i en 2 ml eppendorf (Eppendorf corp. Hamburg, Tyskland) for å blande med 1200 mikroL TRIzol (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) og 5 mikroL miR-39 (5x10^-15 mol/mikroL), eksogen kontroll, av C. elegans samt 2 mikrog (10 mikrog/ml i plasma) gjær-RNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 15 minutter ved romtemperatur. Ytterligere 320 mikroL kloroform ble tilsatt og plassert ved romtemperatur i 5 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 12000 xg i 15 minutter ved 4 ℃ og 300 mikroL fargeløst væskelag ble aspirert for å blandes med 900 mikroL iset 100 % etanol over natten ved -80 ℃. Den forberedte prøven ble plassert i Direct-zol-kolonnen (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research corp., Irvine, CA, USA) og ble deretter sentrifugert ved 12000 xg i 30 sek. Kolonnen ble deretter overført til et nytt oppsamlingsrør og ble sentrifugert ved 12000 xg i 30 sekunder etter blanding med 400 mikroL RNA-vaskebuffer. DNase I-reaksjonsblanding på 80 mikroL (DNase I-enzym 5 mikroL+DNA-fordøyelsesbuffer 75 mikroL) ble tilsatt til røret etter å ha kastet RNA-vaskebufferen og ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Ytterligere 400 mikroL forvaskebuffer ble innført i røret og ble sentrifugert ved 12000 xg i 30 sekunder. Kolonnen ble deretter overført til et nytt 1,5 ml RNase-fritt rør og ble behandlet med 80 mikroL nukleasefritt vann ved romtemperatur i 2 minutter. Den forberedte prøven ble sentrifugert ved 12000 xg i 2 minutter for å eluere RNA-løsning.

Kvantifisering av plasma-mikroRNA-nivåer miR-21, miR-126, miR-146a og miR-222-nivåer på de tre forskjellige tidspunktene ovenfor ble analysert. Ett-trinns sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ble utført ved bruk av et RT-qPCR-system (T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA) for å vurdere plasma mikroRNA-nivåer. En blanding av 100 ng total RNA-ekstraksjon, 10 mikroL TaqMan-masterblanding (ThermoFisher), 5,8 mikroL nukleasefritt vann, 0,2 mikroL universalprobebibliotek 21 (10 mikroM), 0,1 mikroL RNase-hemmer, egenkonstruerte 1 mikroL fremre primere og 1 microL reverse primere for miR-39, miR-126 og miR-146a, og 2 mikroL cDNA-mal ble laget på is. Alle reaksjoner ble inkubert i en 48-brønns plate ved 95°C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95°C i 5 sekunder, 60°C i 10 sekunder og 72°C i 1 sek. Selvkonstruerte forover- og reversprimersekvenser for primær C. elegans miR-39 (C-miR-39) som eksogen kontroll. Human miR-126 (miR-126) og miR-146a (miR-146a) (tilleggstabell 1) ble normalisert av den eksogene kontrollen og ble brukt til å bestemme mikroRNA-nivåuttrykkene under oppfølgingen.

miRCURY LNA SYBR Green PCR-sett (Qiagen) ble brukt til å bestemme humant miR-21 (miR-21) og miR-222 (miR-222). En blanding av 4 mikroL 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer, 2 mikroL 10X miRCURY RT Wnzyme Mix og 14 mikroL 100 ng total RNA-ekstraksjon i nukleasefritt vann ble inkubert i en 48-brønns plate ved 42°C i 60 minutter og etterfulgt av 95°C for å generere cDNA. En blanding inneholdende 2 mikroL C-miR-39 (eller miR-21/ eller miR-222) primere kjøpt fra Qiagen, 10 mikroL miRCURY SYBR Green Master Mix, 2 mikroL nukleasefritt vann og 6 mikroL 5X generert cDNA-mal ble inkubert kl. 95 °C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med 95 °C i 10 sekunder og 56 °C i 60 sekunder. has-miR-21 og hsa-miR-222 ble normalisert av C-miR-39 og ble brukt til å bestemme mikroRNA-nivåuttrykkene under oppfølgingen.

Bestemmelse av inflammatorisk aktivitet 300 mikroL serum ble fortynnet i forhold 1:2. Lastet 50 mikroL forberedte prøver per brønn og kalibratorer i duplikat på analyseplaten (Multiplex Human Cytokine Panel 1, Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Hver brønn som inneholdt antistoffer fanget IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10 og TNFα. En blanding som inneholder biotinylerte analyttspesifikke antistoffer tilsettes etter å ha vasket bort eventuelt ubundet protein. De biotinylerte antistoffene fullførte sandwichen for hver spesifikk arrayed analytt. Etter å ha vasket bort ubundet biotinylert antistoff, tilsettes streptavidin pepperrotperoksidase (SHRP). Etter en ekstra vask er mengden av SHRP som er igjen på hver plassering av matrisen proporsjonal med mengden av de ovenfor opprinnelig fangede cytokinene. Mengden av konjugert enzym på hver plassering av matrisen måles ved tilsetning av et kjemiluminescerende substrat.

Statistisk analyse Data presenteres som gjennomsnitt (95 % KI) eller n (%). Forskjeller av kontinuerlige og nominelle parametere og mellom de to gruppene ble estimert av henholdsvis student-t og kjikvadrat tester. Gjentatt måling ANOVA ble utført for å analysere forskjeller mellom kontinuerlige parametere målt på de tre tidspunktene i hver gruppe. Pearson-korrelasjon ble utført for å finne forholdet mellom fysisk form og miRNA. En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikans.