Nadzorowane efekty ćwiczeń fizycznych na starszych mieszkańcach społeczności

Projekt Instytucjonalna komisja rewizyjna szpitala trzeciego stopnia zatwierdziła badanie (nr IRB: 201602058A3C502 i NCT04839796). Od maja do listopada 2021 r. przeprowadzono randomizowane, kontrolowane badanie z oceniającym i zaślepionym badaniem dotyczącym wpływu schematów ćwiczeń na osoby starzejące się. Wszyscy badani wyrazili świadomą zgodę po zapoznaniu się z procedurami eksperymentalnymi. Uczestnicy zostali następnie losowo przydzieleni do poddania się 30-minutowemu nadzorowanemu treningowi wysiłkowemu (SET) w ciągłym treningu o umiarkowanej intensywności (MICT) na 24 sesje w grupach szpitalnych lub domowych (HET), korzystając z wygenerowanego komputerowo, ukrytego harmonogramu przydziału. Dane zostały zebrane przez zaślepioną osobę oceniającą przed randomizacją i po zakończeniu treningu fizycznego.

Uczestnicy Badaniem objęto osoby mieszkające w gminie w wieku >=55 lat, które mieszkały w sąsiedztwie szpitala gminnego. Zrekrutowano osoby w podeszłym wieku z wynikiem mini-mental state assessment (MMSE) > 24 i ujemnym kręgosłupem lędźwiowym oraz chorobą zwyrodnieniową stawów kończyn dolnych. Osoby, które miały niestabilne objawy kliniczne wymienione w naszych poprzednich badaniach lub sarkopenię, zdiagnozowaną na podstawie rekomendacji Azjatyckiej Grupy Roboczej ds. Sarkopenii, nie były kandydatami do badania. Wykluczyliśmy również osoby z bezwzględnymi przeciwwskazaniami do aktywności aerobowej, sugerowanymi przez American College of Sports Medicine (ACSM). Wyjściowy wynik komponentu fizycznego (PCS) i wynik komponentu psychicznego (MCS) w skróconym formularzu 36 badania wyników medycznych (SF-36) zostały wykorzystane do oceny jakości życia (QoL) i zostały ponownie ocenione 24 tygodnie po rekrutacji. Wyjściowe cechy demograficzne i informacje kliniczne włączonych uczestników zostały starannie zapisane.

Trening fizyczny Wszyscy uczestnicy zostali poinstruowani, aby nosili inteligentny zegarek (WDI08, WisDat Inc., Taichung, Tajwan) i robili co najmniej 8000 kroków dziennie (stp/d). Oprócz 8000 stp/d, uczestnicy SET przeszli 24 sesje nadzorowanego MICT (70% maksymalnego przewidywanego tętna) przez 30 minut na ergometrze rowerowym (Ergoselect 150P, ergoline GmbH, Bitz, Niemcy) w naszym szpitalu podczas 8. -okres tygodniowy. Wszystkim badanym przypominano przez telefon i aplikację, aby przyjmowali >=8000 stp/d co tydzień przez pierwsze 8 tygodni po rekrutacji. Po ukończeniu MICT uczestnicy SET zostali poinstruowani, aby przyjmować >=8000 stp/d przez kolejne 16 tygodni. Uczestnicy HET zostali poinstruowani, aby przyjmowali 8000 stp / dzień przez 24-tygodniowy okres obserwacji. W ciągu ostatnich 16 tygodni nie u wszystkich badanych przypominano o zaleceniu przyjmowania >=8000 stp/d. Trening wysiłkowy zakończono, gdy podmiot miał objawy podczas ćwiczeń zgodnie z wytycznymi ACSM.20 Pomiar sprawności fizycznej Inteligentny zegarek noszony na nadgarstku (WDI08, Wisdat Inc., Taichung, Tajwan) rejestrował codzienną liczbę kroków i wydatek energetyczny każdego badanego oraz średnią liczbę kroków i dzienny wydatek energetyczny (Kcal) w tydzień reprezentował średnie codzienne kroki i wydatek energetyczny tygodnia w społeczności podczas 24-tygodniowego okresu obserwacji.

Obwód łydki (obwód łydki) uzyskano przez uśrednienie największego obwodu łydki w obu nogach. Inteligentna analiza ruchu (eFitHealth, uCare Medical Electronics, Co. Ltd., Miaoli, Tajwan) z wykorzystaniem interaktywnych głosów i przewodników po obrazach głębi 3D do oceny 2-minutowej liczby kroków, 5-krotnego czasu trwania z pozycji siedzącej do wstania oraz pozycji siedzącej i stojącej na krześle odległość zasięgu (dane uzupełniające 1). Każdy z powyższych testów został wykorzystany do oszacowania odpowiednio VO2max (eV O2max), siły mięśni kończyn dolnych i elastyczności.21 Zmierzono skład ciała, w tym całkowitą wodę w organizmie (TBW), zawartość składników mineralnych, ilość białka (Prot), beztłuszczową masę ciała (LBM), masę mięśni szkieletowych (SKM), masę tkanki tłuszczowej (BFM) i podstawową przemianę materii (BMR). za pomocą analizy bioimpedancji wielu częstotliwości (Inbody 720, Inbody Co., Ltd., CA, USA). Powyższe pomiary zostały udokumentowane przed, 8 tygodni po i 24 tygodnie po pierwszej wizycie.

Ekstrakcja RNA Próbki krwi po 10 ml pełnej krwi od każdego osobnika podczas rekrutacji, 8 tygodnia i 24 tygodnia od pierwszej wizyty umieszczono w probówce zawierającej 3,2% cytrynianu sodu. Następnie próbki wirowano przy 360 x g przez 15 minut, a supernatant następnie wirowano przy 2400 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej 25 ℃, aby utrzymać liczbę płytek w osoczu poniżej 2,5 x 10^8/ml. Przetworzone osocze o objętości 400 mikrolitrów umieszczono w 2 ml eppendorf (Eppendorf corp. Hamburg, Niemcy) do zmieszania z 1200 mikroL TRIzolu (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) i 5 mikroL miR-39 (5x10^-15 mol/mikroL), kontrola egzogenna C. elegans oraz 2 mikrog (10 mikrogramów/ml w osoczu) RNA drożdży (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodano kolejne 320 mikrolitrów chloroformu i umieszczono w temperaturze pokojowej na 5 minut. Próbkę wirowano przy 12000 xg przez 15 minut w temperaturze 4°C i odessano 300 mikrolitrów bezbarwnej warstwy płynu w celu wymieszania z 900 mikrolitrów 100% etanolu z lodem przez noc w temperaturze -80°C. Przygotowaną próbkę umieszczono w kolumnie Direct-zol (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research corp., Irvine, CA, USA), a następnie wirowano przy 12000 xg przez 30 sekund. Następnie kolumnę przeniesiono do nowej probówki zbierającej i wirowano przy 12000 xg przez 30 sekund po zmieszaniu z 400 mikrolitrów buforu do przemywania RNA. Mieszaninę reakcyjną DNazy I w objętości 80 mikrolitrów (5 mikrolitrów enzymu DNazy I + 75 mikrolitrów buforu do trawienia DNA) dodano do probówki po odrzuceniu buforu do przemywania RNA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do probówki wprowadzono dodatkowe 400 mikrolitrów buforu do przemywania wstępnego i wirowano przy 12000 xg przez 30 sekund. Kolumnę następnie przeniesiono do nowej 1,5 ml probówki wolnej od RNazy i traktowano 80 mikrol wody wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Przygotowaną próbkę wirowano przy 12000 xg przez 2 minuty w celu wymycia roztworu RNA.

Przeanalizowano ilościowe oznaczenie poziomów mikroRNA w osoczu miR-21, miR-126, miR-146a i miR-222 w powyższych trzech różnych czasach. Jednoetapową ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) przeprowadzono przy użyciu systemu RT-qPCR (T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA) w celu oceny poziomów mikroRNA w osoczu. Mieszanina 100 ng ekstrakcji całkowitego RNA, 10 mikroL Master Mix TaqMan (ThermoFisher), 5,8 mikroL wody wolnej od nukleaz, 0,2 mikroL uniwersalnej biblioteki sond 21 (10 mikroM), 0,1 mikroL inhibitora RNazy, samodzielnie skonstruowanych 1 mikroL starterów do przodu i 1 Na lodzie utworzono startery odwrotne microL dla miR-39, miR-126 i miR-146a oraz 2 mikroL matrycy cDNA. Wszystkie reakcje inkubowano w 48-dołkowej płytce w 95°C przez 3 min, a następnie 40 cykli w 95°C przez 5 sek., 60°C przez 10 sek. i 72°C przez 1 sek. Samodzielnie skonstruowane sekwencje starterów do przodu i do tyłu dla pierwotnego C. elegans miR-39 (C-miR-39) jako kontrola egzogenna. Ludzki miR-126 (miR-126) i miR-146a (miR-146a) (tabela uzupełniająca 1) znormalizowano przez kontrolę egzogenną i zastosowano do określenia ekspresji poziomów mikroRNA podczas obserwacji.

Do określenia ludzkiego miR-21 (miR-21) i miR-222 (miR-222) użyto zestawu miRCURY LNA SYBR Green PCR (Qiagen). Mieszaninę 4 mikroL 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer, 2 mikroL 10X miRCURY RT Wnzyme Mix i 14 mikroL ekstrakcji 100 ng całkowitego RNA w wodzie wolnej od nukleaz inkubowano w 48-dołkowej płytce w 42°C przez 60 min i następnie 95°C w celu wytworzenia cDNA. Mieszaninę zawierającą 2 mikroL starterów C-miR-39 (lub miR-21/ lub miR-222) zakupionych w firmie Qiagen, 10 mikroL miRCURY SYBR Green Master Mix, 2 mikroL wody wolnej od nukleaz i 6 mikroL matrycy cDNA wygenerowanej 5X inkubowano w temp. 95°C przez 2 min, a następnie 40 cykli w 95°C przez 10 sek. i 56°C przez 60 sek. has-miR-21 i hsa-miR-222 zostały znormalizowane przez C-miR-39 i zostały użyte do określenia ekspresji poziomów mikroRNA podczas obserwacji.

Oznaczanie aktywności zapalnej 300 mikrolitrów surowicy rozcieńczono w stosunku 1:2. Załadowano 50 mikrolitrów przygotowanych próbek na studzienkę i kalibratory w dwóch powtórzeniach na płytkę testową (Multiplex Human Cytokine Panel 1, Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Każda studzienka zawierająca przeciwciała wychwytywała IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10 i TNFα. Mieszaninę zawierającą biotynylowane przeciwciała swoiste dla analitu dodaje się po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych białek. Biotynylowane przeciwciała uzupełniały kanapkę dla każdego specyficznego ustawionego analitu. Po wypłukaniu niezwiązanego biotynylowanego przeciwciała dodaje się streptawidynę peroksydazę chrzanową (SHRP). Po dodatkowym przemyciu ilość SHRP pozostająca w każdym miejscu macierzy jest proporcjonalna do ilości powyższych początkowo wychwyconych cytokin. Ilość skoniugowanego enzymu w każdym miejscu macierzy mierzy się z dodatkiem substratu chemiluminescencyjnego.

Analiza statystyczna Dane przedstawiono jako średnią (95% CI) lub n (%). Różnice parametrów ciągłych i nominalnych oraz między dwiema grupami oszacowano odpowiednio za pomocą testów t-studenta i chi-kwadrat. Powtórzony pomiar ANOVA przeprowadzono w celu przeanalizowania różnic parametrów ciągłych mierzonych w trzech punktach czasowych w każdej grupie. Przeprowadzono korelację Pearsona, aby znaleźć związek między sprawnością fizyczną a miRNA. Wartość p mniejszą niż 0,05 uznano za istotność statystyczną.