Efeitos do treinamento de exercícios supervisionados em moradores mais velhos da comunidade

Projeto O Conselho de Revisão Institucional de um hospital terciário aprovou o estudo (IRB No.: 201602058A3C502 e NCT04839796). Um estudo controlado randomizado com avaliador e estudo cego para efeitos de regimes de exercícios em pessoas idosas foi realizado de maio a novembro de 2021. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado após a compreensão dos procedimentos experimentais. Os participantes foram então alocados aleatoriamente para passar por 30 minutos de treinamento de exercício supervisionado (SET) em treinamento contínuo de intensidade moderada (MICT) por 24 sessões no hospital ou grupos de treinamento de exercícios em casa (HET) usando um cronograma de alocação oculto gerado por computador. Os dados foram coletados por um avaliador cego antes da randomização e após a conclusão do treinamento físico.

Participantes Indivíduos residentes na comunidade com idade>=55 anos, que residiam ao lado de um hospital comunitário, foram pesquisados. Foram recrutados idosos com pontuação no miniexame do estado mental (MEEM) > 24 e coluna lombar negativa, bem como distúrbio degenerativo das articulações dos membros inferiores. Aqueles que apresentavam quadros clínicos instáveis ​​mencionados em nossos estudos anteriores, ou sarcopenia, diagnosticada com base na recomendação do Asian Working Group for Sarcopenia, não eram candidatos ao estudo. Também excluímos indivíduos com contraindicações absolutas para atividades aeróbicas, sugeridas pelo American College of Sports Medicine (ACSM). O escore do componente físico (PCS) e o escore do componente mental (MCS) no Medical Outcomes Study Short Form 36 (SF-36) foram usados ​​para avaliar a qualidade de vida (QoL) e foram reavaliados 24 semanas após o recrutamento. As características demográficas basais e as informações clínicas dos participantes incluídos foram cuidadosamente registradas.

Treinamento de exercícios Todos os indivíduos foram instruídos a usar um relógio inteligente (WDI08, WisDat Inc., Taichung, Taiwan) e a dar pelo menos 8.000 passos por dia (stp/d). Além de 8.000 stp/d, os participantes do SET foram submetidos a 24 sessões de MICT supervisionado (70% da FC máxima prevista) por 30 minutos em uma bicicleta ergométrica (Ergoselect 150P, ergoline GmbH, Bitz, Alemanha) em nosso hospital durante um período de 8 período de -semana. Todos os indivíduos foram lembrados de tomar >=8000 stp/d todas as semanas durante as primeiras 8 semanas após o recrutamento por telefonema e aplicativo. Depois de completar o MICT, os participantes do SET foram instruídos a tomar >=8000 stp/d por mais 16 semanas. Os participantes HET foram instruídos a tomar 8.000 stp/d durante o período de acompanhamento de 24 semanas. Durante as últimas 16 semanas, a instrução de tomar>=8000 stp/d não foi lembrada em todos os assuntos. O treinamento físico foi encerrado quando o sujeito apresentou sintomas/sinais durante o exercício de acordo com a diretriz do ACSM.20 Medição da aptidão física O relógio inteligente de pulso (WDI08, Wisdat Inc., Taichung, Taiwan) registrou a contagem diária de passos e o gasto de energia em cada sujeito, e o número médio de passos e gasto de energia (Kcal) por dia em uma semana representou a média diária de passos e gasto energético de uma semana na comunidade durante o período de acompanhamento de 24 semanas.

A circunferência da panturrilha (Calf_circ) foi obtida pela média do maior Calf_circ nas pernas bilaterais. Análise de movimento inteligente (eFitHealth, uCare Medical Electronics, Co. Ltd., Miaoli, Taiwan) usando vozes interativas e guias de imagem de profundidade 3D para avaliar o número de passos de 2 minutos, a duração de sentar para levantar de 5 vezes e sentar e sentar na cadeira -distância de alcance (Dados Suplementares 1). Cada um dos testes acima foi usado para estimar VO2max (eV O2max), força muscular de membros inferiores e flexibilidade, respectivamente.21 Composição corporal, incluindo água corporal total (TBW), porção mineral, quantidade de proteína (Prot), massa corporal magra (LBM), massa muscular esquelética (SKM), massa gorda corporal (BFM) e taxa metabólica basal (BMR) foram medidos por análise de bioimpedância de múltiplas frequências (Inbody 720, Inbody Co., Ltd., CA, EUA). As medições acima foram documentadas antes, 8 semanas depois e 24 semanas após a visita inicial.

Extração de RNA Amostras de sangue de 10 ml de sangue total de cada indivíduo no recrutamento, 8 semanas e 24 semanas a partir da visita inicial foram colocadas em um tubo contendo 3,2% de citrato de sódio. As amostras foram então centrifugadas a 360xg por 15 min, cujo sobrenadante foi posteriormente centrifugado a 2400xg por 20 min à temperatura ambiente de 25 ℃ para manter a contagem de plaquetas plasmáticas inferior a 2,5 × 10^8/ml. O plasma processado de 400 microL foi colocado em um eppendorf de 2mL (Eppendorf corp. Hamburgo, Alemanha) para misturar com 1200 microL de TRIzol (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e 5 microL de miR-39 (5x10^-15 mol/microL), controle exógeno, de C. elegans, bem como 2 microg (10 microg/mL no plasma) RNA de levedura (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 15 min em temperatura ambiente. Outros 320 microL de clorofórmio foram adicionados e colocados em temperatura ambiente por 5 min. A amostra foi centrifugada a 12.000 xg por 15 min a 4 ℃ e 300 microL de camada de fluido incolor foi aspirado para misturar com 900 microL de etanol 100% gelado durante a noite a -80 ℃. A amostra preparada foi colocada na coluna Direct-zol (Direct-zol RNA Miniprep, Zymo Research corp., Irvine, CA, EUA) e foi então centrifugada a 12.000 xg por 30 segundos. A coluna foi então transferida para um novo tubo de coleta e foi centrifugada a 12.000 xg por 30 segundos após a mistura com 400 microL de tampão de lavagem de RNA. A mistura de reação de DNase I de 80 microL (enzima DNase I 5 microL + tampão de digestão de DNA 75 microL) foi adicionada ao tubo após descartar o tampão de lavagem de RNA e foi incubada em temperatura ambiente por 15 min. Adicional 400 microL de tampão de pré-lavagem foi introduzido no tubo e foi centrifugado a 12.000 xg por 30 segundos. A coluna foi então transferida para um novo tubo de 1,5 mL livre de RNase e foi tratada com 80 microL de água livre de nuclease à temperatura ambiente por 2 minutos. A amostra preparada foi centrifugada a 12.000 xg por 2 min para eluir a solução de RNA.

Foi analisada a quantificação dos níveis de microRNA plasmático miR-21, miR-126, miR-146a e miR-222 nos três tempos diferentes acima. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real em uma etapa (RT-qPCR) foi realizada usando um sistema RT-qPCR (T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, EUA) para avaliar os níveis de microRNA no plasma. Uma mistura de 100 ng de extração de RNA total, 10 microL de TaqMan master mix (ThermoFisher), 5,8 microL de água livre de nuclease, 0,2 microL da biblioteca universal de sondas 21 (10 microM), 0,1 microL de inibidor de RNase, 1 microL de primers avançados autoconstruídos e 1 Iniciadores reversos microL para miR-39, miR-126 e miR-146a e 2 microL modelo de cDNA foram criados em gelo. Todas as reações foram incubadas em uma placa de 48 poços a 95°C por 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C por 5 segundos, 60°C por 10 segundos e 72°C por 1 segundo. Sequências de primer direto e reverso autoconstruídas para C. elegans miR-39 primário (C-miR-39) como controle exógeno. O miR-126 humano (miR-126) e o miR-146a (miR-146a) (Tabela Suplementar 1) foram normalizados pelo controle exógeno e foram usados ​​para determinar as expressões dos níveis de microRNA durante o acompanhamento.

O kit miRCURY LNA SYBR Green PCR (Qiagen) foi usado para determinar miR-21 (miR-21) e miR-222 (miR-222) humanos. Uma mistura de 4 microL 5X miRCURY RT SYBR Green Reaction Buffer, 2 microL 10X miRCURY RT Wnzyme Mix e 14 microL de 100 ng de extração de RNA total em água livre de nuclease foi incubada em uma placa de 48 poços a 42°C por 60 min e seguido de 95°C para gerar cDNA. Uma mistura contendo 2 microL de primers C-miR-39 (ou miR-21/ ou miR-222) adquiridos da Qiagen, 10 microL de miRCURY SYBR Green Master Mix, 2 microL de água livre de nuclease e 6 microL de modelo de cDNA gerado 5X foi incubada em 95°C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C por 10 segundos e 56°C por 60 segundos. has-miR-21 e hsa-miR-222 foram normalizados pelo C-miR-39 e foram usados ​​para determinar a expressão dos níveis de microRNA durante o acompanhamento.

Determinação da atividade inflamatória Foram diluídos 300 microL de soro na proporção de 1:2. Carregou 50 microL de amostras preparadas por poço e calibradores em duplicado na placa de ensaio (Multiplex Human Cytokine Panel 1, Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, EUA). Cada poço contendo anticorpos capturou IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNFα. Uma mistura que contém anticorpos específicos do analito biotinilado é adicionada após a lavagem de qualquer proteína não ligada. Os anticorpos biotinilados completaram o sanduíche para cada analito específico. Depois de lavar o anticorpo biotinilado não ligado, adiciona-se estreptavidina peroxidase de rábano (SHRP). Após uma lavagem adicional, a quantidade de SHRP restante em cada local da matriz é proporcional à quantidade das citocinas inicialmente capturadas acima. A quantidade de enzima conjugada em cada local da matriz é medida com a adição de um substrato quimioluminescente.

Análise estatística Os dados são apresentados como média (IC 95%) ou n (%). Diferenças de parâmetros contínuos e nominais e entre os dois grupos foram estimadas pelos testes t de Student e qui-quadrado, respectivamente. ANOVA de medição repetida foi conduzida para analisar diferenças de parâmetros contínuos medidos nos três pontos de tempo em cada grupo. A correlação de Pearson foi realizada para encontrar a relação entre aptidão física e miRNAs. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado como significância estatística.