敗血症における肥満と免疫代謝 (AIMS)

仮説 仮説は、敗血症で重症の患者の脂肪組織は、敗血症のない対照患者と比較して、構造の変化、炎症機能の増加、ミトコンドリア機能不全の増加を示すというものです。 研究者らはまた、炎症機能の増加は、SAT よりも VAT でより顕著になるだろうと仮説を立てています。

目的 研究者らは、敗血症患者と非敗血症患者の間、および SAT と VAT の間の脂肪組織構造、炎症機能、およびミトコンドリア機能不全における潜在的な差異を調査することを目的としています。

研究デザイン

2 つの患者コホートが存在します。

1. 敗血症の診断で緊急手術を受ける患者

   ａ． 15～30人の患者

2. 敗血症の診断で救命救急病棟に入院した患者

   1. 15～30人の患者

      敗血症患者からの結果は、以前の研究（CONNECT 研究：IRAS プロジェクト ID 291251; REC 参照 21/NS/0015）に募集された患者のコホートから得られた結果と比較されます。 これらの患者は、急性炎症過程の証拠がなく、待機的な腹部手術を受ける際に集められます。 研究に参加させられると、この研究で説明されているのと同じ脂肪と血液のサンプリングプロセスが行われます。

      研究の設定 患者は、グラスゴーのクイーンエリザベス大学病院の手術室および救命救急病棟から集められます。

      脂肪組織サンプルは、救命病棟または手術室のいずれかで、気管挿管に鎮静または全身麻酔が必要な患者からのみ採取されます。

      同意 同意プロセス ICU にいる患者、特に病気の急性期には、せん妄や鎮静剤の影響により、意思決定能力が欠けていることがよくあります。 重篤な病気の急性期に脂肪組織に起こる変化を評価するには、患者が ICU に入院した後、できるだけ早くサンプリングを開始することが重要です。 この研究で ICU に集められた患者は、この研究への登録に前向きに同意できないことが予想されます。 したがって、研究者は福祉弁護士、福祉後見人、または最も近い親族の同意を求めることになります。 この研究者は、ヘルシンキ宣言およびスコットランド無能力成人法（2000 年）の倫理原則に準拠した同意手順の研修を受けます。 研究者は研究情報シートと同意書を提供し、研究の手順、利点、リスクが理解されていることを確認するために内容を確認します。 アプローチを受ける人は、能力がある場合、患者の希望の認識に基づいて同意を与えるよう求められます。 その後、同意書に署名するよう求められます。 原本は治験責任医師サイトのファイルに保存され、コピーはフォームに署名した人に渡され、別のコピーは患者の医療記録に保管されます。

      継続に対する患者の同意 厚生弁護士、福祉後見人、または最も近い親族によって研究に同意した患者は、重篤な病気の後に能力が回復した時点で、研究を継続する許可を得るためにアプローチされます。 患者には、適切な訓練を受けた研究チームのメンバーがアプローチし、研究情報シートと継続同意書のコピーが提供されます。 研究者は患者と一緒にこれらの内容を検討し、説明を提供し、質問の機会を提供します。 この段階で参加を辞退した患者は研究から除外されます。

      研究からの撤退 参加者は、いかなる不利益も被ることなく、いつでも研究から撤退することができます。

      研究手順 臨床データの収集

      ベースラインデータは、研究に採用されたすべての患者について収集されます。 これには以下が含まれますが、これらに限定されません。

      • 年
      • セックス
      • BMI
      • 主な併存疾患

      ICU に入院している患者については、急性疾患に関するさらなるデータが収集されます。 これには以下が含まれますが、これらに限定されません。

      • アパッチⅡ

      • 臨床的に測定される生化学的パラメータおよび血液学的パラメータ:

        • 最初の 48 時間で最高の C 反応性タンパク質
        • 最初の 48 時間で白血球数が最も多くなる
        • 最初の 48 時間で最高のプロカルシトニン
        • 最初の 48 時間で最高の乳酸塩

      • 生理学的パラメータ:

        • 最初の 48 時間の最高心拍数 (1 分あたりの拍数)
        • 最初の 48 時間のノルアドレナリンの最高用量 (mcg/分)
        • 最初の 48 時間で最も低い P:F 比
        • 最初の 48 時間で投与されるインスリンの最高用量 (単位/時間)

      • 結果データ:

        • ICU滞在期間
        • ICUの結果
        • 侵襲的人工呼吸器を必要とする日数
        • 心血管サポートが必要な日数
        • 腎代替療法が必要な日数
        • 入院期間
        • 病院での転帰

      画像データ収集

      研究者は、研究に参加した各患者について取得した臨床画像を検討します。 ICU への入院前の 12 か月以内、または入院後 48 時間以内に L3 脊椎レベルを含む CT スキャンを受けた患者は、CT 由来の体組成分析に適しています。 L3 椎骨のレベルで単一の画像スライスが取得されます。 この画像は匿名化され、PACS から NHS グレーター グラスゴー アンド クライドのコンピューターにダウンロードされます。 匿名化された画像は CoreSlicer ソフトウェア プログラムにアップロードされ、前述のように分析されます (35)。 これにより、内臓脂肪組織、皮下脂肪組織、筋肉量の面積を計算することができます。 これにより、BMI 単独よりも個人の肥満度のより微妙な評価が得られる可能性があります。

      血液および脂肪組織のサンプリング 血液サンプリング 研究への採用時に訓練を受けたスタッフによって最大 40 ml の血液が収集されます。

      救命救急病棟の患者における脂肪組織サンプリング 脂肪組織は、14G 80mm ステリカン単回使用深部筋肉注射針に取り付けられた 20ml テルモ™ ルアー チップ シリンジを使用して、滅菌条件下で臍の外側 5 cm で採取されます 約 5ml の 0.9% があらかじめ充填されています生理食塩水。 各生検パスでは平均 0.3 g の組織が収集されるため、3 回のパスで最大 1 g の脂肪組織が得られるはずです。 これを100μmのナイロンメッシュフィルターで濾過し、あらかじめ温めた(37℃)Gibco™培地199、ハンクス平衡塩類溶液15mlに入れて研究室に輸送します。

      緊急手術を受ける患者における脂肪組織のサンプリング 皮下脂肪組織と内臓脂肪組織の両方が、外科チームによって直視下で採取されます。 各部位から約 1g の組織が採取されます。 これは、あらかじめ温めた (37℃) Gibco™ Medium 199、Hanks' Balanced Salts 溶液 15 ml に入れて研究室に輸送されます。

      グラスゴー大学へのサンプルの輸送 すべてのサンプル (血液および脂肪組織) は、現在のスコットランド健康保護ガイダンスに従って、グラスゴー大学に輸送するために梱包されます。

      被験者の参加の予想所要時間 血液採取と脂肪採取を含む手順全体にかかる時間は 30 分未満です。

      脂肪組織分析 1g の脂肪組織生検から、300μl の 90% サイトクリット脂肪細胞および間質血管画分 (SVF) を調製できます。 追加の脂肪組織が利用可能な場合は、後の組織学的分析のために液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保存します。

      脂肪細胞のサイジングは、生検のコラゲナーゼ消化によって分離された未固定の新鮮な脂肪細胞懸濁液 (5μL) で実行され、Image J 自動化によるデジタル画像キャプチャ用の 3-CCD カラー カメラ (JVC) に接続された x10 レンズを使用してオリンパス BX50 顕微鏡で画像化されます。サイズ感。

      基底およびリポ多糖 (1μM) によって刺激されたアディポカイン分泌は、脂肪細胞懸濁液 DNA 濃度 (RNA と同時に単離) を使用して細胞数について補正され、前述のように、37℃で 2 時間後に単離された脂肪細胞で評価されます (アッセイあたり 50 μL を 2 回ずつ)。 (36)。

      脂肪細胞の炎症性遺伝子発現は、TRIzol (ThermoFisher Scientific) を使用して、脂肪細胞懸濁液 (95 μL、約 500 ng の RNA が得られます) から単離された RNA 中の内因性コントロール PPIA と比較して定量されます。 選択された標的は RNA 内で事前に増幅され、その後市販のプライマー プローブ セット (ThermoFisher Scientific) を使用して Taqman RT-PCR 定量が行われます。

      SVF細胞は、25cm2フラスコ内、37℃、5%CO2インキュベーター、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養され、サイトカインの分析のために2時間目と24時間目にサンプリングされます。 培養（継代0）は、前脂肪細胞が80％コンフルエントになるまで継代され（継代1）、前脂肪細胞が80％コンフルエントになるまで3〜4日ごとに培地を交換しながら、前脂肪細胞が接着できるように継続されます。 継代 1 の終わりに前駆脂肪細胞を剥離し、DMEM、20% FBS、10% ジメチルスルホキシド [DMSO、DLM-10RG-PK]、100 U/mL ペニシリン - ストレプトマイシン、および 2 mM L-グルタミン）を使用し、後の前脂肪細胞分化の分析のために液体窒素中に保存しました。

      サイトカインの定量は、MAGPIX® xPONENT 4.2 システム上の磁気ビーズ マルチプル アレイ (Merck Millipore) を使用するか、市販の ELISA によって実行されます。

      脂肪組織の血管新生と線維化は、OCT に埋め込まれた利用可能な凍結生検で評価されます。 凍結切片 (10μm) は抗 CD31 抗体を使用して免疫染色され、血管が識別されます。 血管密度は、総断面積に対する血管数の比率として計算されます。 脂肪組織の線維化は、ピコシリウス レッドおよびイメージ J 分析を使用して評価されます。

      脂肪細胞は、メーカーの指示に従って MitoTracker Green FM および MitoTracker Red で染色され、BHF GCRC Imaging Suite の蛍光顕微鏡を使用して画像化されます。 Mitomorph ソフトウェアを使用して画像を分析し、ミトコンドリアの形態 (相互接続性、サイズ、膨潤) を評価します。 脂肪細胞のミトコンドリア含有量も、JC-1 染色後にセロメーターで細胞ごとの蛍光強度として評価されます。 ミトコンドリア含有量は、Taqman RT-PCR による MT-CO2、MT-CYB、PPARG、および UCP1 発現を使用した mtDNA/核 DNA 比の独立した方法を使用して確認されます。

      ミトコンドリアの分裂/融合は、Taqman RT-PCR およびウェスタンブロッティングを使用して、ミトコンドリアの分裂 (DNM1L) および融合 (MFN1、MFN2、および RHOT1) に関与する遺伝子/タンパク質の発現を定量することによって推定されます。

      ミトコンドリア呼吸複合体および脂肪酸酸化タンパク質の遺伝子およびタンパク質の発現は、それぞれTaqman RT-PCRおよびウェスタンブロッティングを使用して実行されます。

      血液サンプル分析 血漿は分離され、アリコートに分けて摂氏 -80 度で凍結されます。 血漿アディポカイン（例、 アディポネクチン、ビスファチン）レベルは、標準製品プロトコルに従って市販の ELISA を使用して測定されます。

      研究における患者の臨床管理 この研究の一環として、患者の臨床管理に変更はありません。

      安全性の評価 有害事象の定義 有害事象 (AE) および重篤な有害事象 (SAE) は、国際調和適正臨床基準会議 (ICH-GCP) の用語集に従って定義されます。

      有害事象 血液および脂肪組織採取のための針穿刺は、ほとんどの患者にとって深刻な問題を引き起こしません。 針による穿刺により、その部位にめまい、不快感、出血、打撲傷、または感染症が生じる可能性があるというわずかなリスクがあります。

      有害事象の記録と報告 サンプル収集に関連する研究に関与した患者における望ましくない医学的出来事は、研究ガバナンスフレームワークに従って記録され、報告されます（つまり、AE の場合は毎年、SAE の場合は 15 日以内）。 予期せぬ、サンプル収集に関連する SAE は、主任研究者がその事象を認識してから 15 日以内に研究倫理委員会に報告されます。 AE および SAE の概要は、研究倫理委員会および NHS GGC の研究開発局に毎年提供されます。 AE および SAE は、研究期間中に症例報告書に収集されます。

      データの収集と管理 ソース データ/文書への直接アクセス 患者固有の情報は、電子患者データ管理システム (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia、Phillips Medical Systems) および Clinical Portal 電子患者記録からアクセスされます。 研究目的でのこれらのデータ システムへのアクセスは、研究チームの適切に委任されたメンバーに限定されます。 内部監査人または外部監査人によるアクセスは、グラスゴー臨床研究施設の関連する標準業務手順に従って管理されます。

      データセンター NHS グレーター グラスゴー アンド クライド (NHS GGC) 内で収集されたすべての識別可能なデータは、NHS GGC 内に残ります。 匿名化されたデータと組織サンプルのみがグラスゴー大学と共有されます。

      すべての組織サンプルはグラスゴー大学心臓血管代謝健康学部 (SCMH) で処理および分析され、余剰サンプルはバイオバンクに保管されます。 バイオバンクに保存された組織サンプルと関連データは、SCMH のポリシーに従って保管および使用されます。

      データアクセス この研究で生成されたデータへのアクセス要求は、主任研究者に行う必要があり、個別のケースバイケースで検討され、治験依頼者と協議されます。

      データの保存 データは研究完了後 5 年間保存され、引き続き主任研究者の責任となります。

      品質保証 研究中および/または研究完了後に、NHS GGC または規制当局によって任命された品質保証担当者が現場監査の実施を希望する場合があります。 主任研究者は、あらゆる監査に協力し、要求に応じて支援と文書（ソースデータを含む）を提供することが期待されます。

      統計 サンプルサイズ 合計 60 人の患者が募集され、そのうち 30 人は緊急手術を受け、30 人は救命救急病棟に入院しています。 (上記の研究デザインで詳しく説明されています)。

      脂肪組織の炎症機能は、救命救急治療を受けている敗血症患者のヒト組織では検査されていません。 これまでの研究では、子癇前症患者と健康な妊娠との間で脂肪細胞のインスリン抵抗性、アディポカイン分泌、および遺伝子発現に有意な差があることが判明しており、各群n=13の患者であった(36,37)。 年齢とBMIが一致したヨーロッパおよび南アジアの男性の間の皮下脂肪細胞の分化を比較した未発表のデータでは、PPARγの効果サイズが0.72であることがわかりました（GPowerを使用して計算）。 この研究では、敗血症患者と対照者の間で同様の効果量が見つかる可能性があると想定し、研究者らは、n=25 人の参加者が同様のレベルの遺伝子発現の差を検出力 80% で検出することを要求しています。 したがって、研究者らは、提案された研究について脂肪細胞機能の有意な違いを示すには、グループあたり n=30 人の患者が十分であると予想しており、一部の不完全な分析を考慮しています。

      統計手法の説明 主な結果は、2元配置分散分析混合モデルを使用して分析されます。 独立変数は、敗血症の有無、およびサンプリングされた脂肪組織蓄積物 (皮下および内臓) になります。 従属変数は分泌されるサイトカインの量になります。 研究者らは、年齢、性別、BMI、および（脂肪組織分布の測定値として）SAT:VAT比（利用可能な場合）など、脂肪組織の分布と機能に影響を与えることが知られている共変量をモデルに含めます。

      SAT と VAT の両方が利用できない分析では、データが正規分布している (またはこれを達成するために変換できる) 2 標本 t 検定を使用して母集団が比較され、ノンパラメトリックに分布している場合はマン ホイットニー u 検定が使用されます。

      使用される有意水準 <0.05 の p 値は、統計的に有意であるとみなされます。 すべての二次分析は純粋に探索的なものであり、仮説を生成するものとして解釈される必要があります。

      倫理と臨床ガバナンス 倫理的承認 このプロトコールおよび修正案は、2000 年成人無能力者法 (スコットランド) に基づく承認が必要な研究を審査する権限を持つスコットランド A 研究倫理委員会 (REC) に提出されます。 REC の文書化された決定のコピーは、研究の正式な承認のために、スポンサーおよび各施設の適切な研究開発 (R&D) オフィスに提供されます。 施設固有の評価を通じて倫理の承認と研究開発管理の承認を与えられた施設のみが研究を開始することが許可されます。

      遵守宣言 この研究は、データ保護法および一般データ保護規則 (GDPR)、ヘルシンキ宣言、および臨床研究を管理するすべての関連ガイドラインと法律の原則を遵守します。 研究者は、医薬品調和適正臨床基準国際会議 (ICH-GCP) ガイドライン (www.ich.org) の原則に従って研究を実施する責任を負います。 研究チームのメンバー全員は GCP トレーニングを完了している必要があります。

      インフォームド・コンセント この研究グループの脆弱性は十分に認識されており、研究グループの安全と幸福を守るためにあらゆる努力が行われます。 適用される規制要件に沿って、研究ガバナンスフレームワークに準拠するために、同意プロセスは標準化され、同意する患者のための堅牢な標準操作手順が遵守されます。 最初の連絡は患者の世話をする臨床スタッフによって行われます。

      患者の機密保持 機密保持を維持するために、すべての症例報告書（CRF）、研究報告書、および研究に関するコミュニケーションでは、割り当てられた一意の研究識別子とイニシャルのみによって患者を特定します。 患者の機密性はあらゆる段階で維持され、適用される法律および規制で認められる範囲でデータが公開されることはありません。

      スポンサー この研究は、NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation によって後援されます。