Otyłość i immunometabolizm w sepsie (AIMS)

Hipoteza Hipoteza jest taka, że ​​tkanka tłuszczowa pacjentów w stanie krytycznym chorych na sepsę będzie wykazywała zmiany w strukturze, zwiększoną funkcję zapalną i zwiększoną dysfunkcję mitochondriów w porównaniu z grupą kontrolną pacjentów bez sepsy. Badacze stawiają również hipotezę, że zwiększona funkcja zapalna będzie bardziej widoczna w badaniu VAT niż w badaniu SAT.

Cele Celem badaczy jest zbadanie potencjalnych różnic w strukturze tkanki tłuszczowej, funkcji zapalnej i dysfunkcji mitochondriów pomiędzy osobami z sepsą i bez niej, a także pomiędzy SAT i VAT.

Projekt badania

Będą dwie grupy pacjentów:

1. Pacjenci poddawani pilnej operacji z rozpoznaniem sepsy

   A. 15-30 pacjentów

2. Pacjenci przyjmowani na oddział intensywnej terapii z rozpoznaniem sepsy

   1. 15-30 pacjentów

      Wyniki uzyskane od pacjentów z sepsą zostaną porównane z wynikami uzyskanymi w kohorcie pacjentów włączonych do poprzedniego badania (badanie CONNECT: identyfikator projektu IRAS 291251; numer referencyjny REC 21/NS/0015). Pacjenci ci są rekrutowani w przypadku poddawania się planowej operacji jamy brzusznej, bez cech ostrego procesu zapalnego. Po włączeniu do badania przechodzą identyczny proces pobierania próbek tłuszczu i krwi jak opisany w tym badaniu.

      Pacjenci będą rekrutowani z sali operacyjnej i oddziałów intensywnej terapii szpitala uniwersyteckiego Queen Elizabeth w Glasgow.

      Próbki tkanki tłuszczowej będą pobierane wyłącznie od osób wymagających sedacji lub znieczulenia ogólnego w celu intubacji dotchawicy, na oddziale intensywnej terapii lub na sali operacyjnej.

      Proces uzyskiwania zgody Pacjenci przebywający na oddziałach intensywnej terapii, zwłaszcza w ostrej fazie choroby, często nie mają zdolności do podejmowania decyzji ze względu na majaczenie i działanie leków uspokajających. Aby ocenić zmiany zachodzące w tkance tłuszczowej w ostrej fazie krytycznego stanu chorobowego, istotne jest pobranie próbek możliwie jak najszybciej po przyjęciu pacjenta na OIOM. Przewiduje się, że pacjenci rekrutowani na OIOM w tym badaniu nie będą mogli prospektywnie wyrazić zgody na włączenie do tego badania. Dlatego badacz będzie musiał uzyskać zgodę prawnika ds. opieki społecznej, opiekuna socjalnego lub najbliższego krewnego. Badacz ten zostanie przeszkolony w zakresie procedur wyrażania zgody zgodnych z zasadami etycznymi zawartymi w Deklaracji Helsińskiej i Ustawie o osobach dorosłych niezdolnych do pracy (2000) w Szkocji. Badacz dostarczy Kartę informacyjną badania i formularz zgody oraz sprawdzi ich zawartość, aby upewnić się, że procedury, korzyści i ryzyko związane z badaniem są zrozumiałe. Osoba, do której się zwracamy, zostanie poproszona o wyrażenie zgody na podstawie tego, jak postrzega życzenia pacjenta, jeśli ma takie możliwości. Następnie zostaną poproszeni o podpisanie formularza zgody. Oryginał zostanie zachowany w aktach ośrodka badawczego, a kopia zostanie przekazana osobie, która podpisała formularz, a druga kopia zostanie umieszczona w dokumentacji medycznej pacjenta.

      Zgoda pacjenta na kontynuację Pacjenci, którzy wyrazili zgodę na badanie przez prawnika ds. opieki społecznej, opiekuna socjalnego lub najbliższego krewnego, zostaną poproszeni o pozwolenie na kontynuację badania, gdy tylko odzyskają zdolność do pracy po ciężkiej chorobie. Odpowiednio przeszkolony członek zespołu badawczego zwróci się do pacjentów i otrzyma Kartę informacyjną badania oraz kopię formularza zgody na kontynuację. Badacz przeanalizuje z pacjentem ich treść, zapewni wyjaśnienia i umożliwi zadawanie pytań. Pacjenci, którzy odmówią udziału na tym etapie, zostaną usunięci z badania.

      Wycofanie się z badania Uczestnicy mogą wycofać się z badania w dowolnym momencie bez ponoszenia jakichkolwiek konsekwencji.

      Procedury badawcze Zbieranie danych klinicznych

      Dane wyjściowe zostaną zebrane dla wszystkich pacjentów włączonych do badania. Będzie to obejmować między innymi:

      • Wiek
      • Seks
      • BMI
      • Główne choroby współistniejące

      W przypadku pacjentów przyjętych na oddział intensywnej terapii zbierane będą dalsze dane dotyczące ich ostrej choroby. Będzie to obejmować między innymi:

      • APASZ II

      • Parametry biochemiczne i hematologiczne mierzone klinicznie:

        • Najwyższe białko C-reaktywne w ciągu pierwszych 48 godzin
        • Najwyższa liczba białych krwinek w ciągu pierwszych 48 godzin
        • Najwyższa prokalcytonina w ciągu pierwszych 48 godzin
        • Najwyższy mleczan w ciągu pierwszych 48 godzin

      • Parametry fizjologiczne:

        • Najwyższe tętno w ciągu pierwszych 48 godzin (w uderzeniach na minutę)
        • Najwyższa dawka noradrenaliny w ciągu pierwszych 48 godzin (w mcg/min)
        • Najniższy stosunek P:F w ciągu pierwszych 48 godzin
        • Najwyższa dawka insuliny dostarczona w ciągu pierwszych 48 godzin (w jednostkach/godz.)

      • Dane wynikowe:

        • Długość pobytu na OIT
        • Wynik OIT
        • Liczba dni wymagających inwazyjnej wentylacji mechanicznej
        • Liczba dni wymagających wspomagania układu krążenia
        • Liczba dni wymagających leczenia nerkozastępczego
        • Długość pobytu w szpitalu
        • Wynik szpitala

      Gromadzenie danych obrazowych

      Badacze dokonają przeglądu badań obrazowych uzyskanych u każdego pacjenta włączonego do badania. Każdy pacjent, który przeszedł tomografię komputerową, obejmującą poziom kręgu L3, w ciągu 12 miesięcy poprzedzających przyjęcie na oddział intensywnej terapii lub w ciągu 48 godzin po przyjęciu, będzie kwalifikował się do analizy składu ciała na podstawie tomografii komputerowej. Uzyskany zostanie pojedynczy wycinek obrazu na poziomie kręgu L3. Obraz ten zostanie następnie zdeidentyfikowany i pobrany z systemu PACS do komputera NHS Greater Glasgow and Clyde. Zdeidentyfikowany obraz zostanie następnie przesłany do programu CoreSlicer i przeanalizowany w sposób opisany wcześniej (35). Pozwoli to na obliczenie powierzchni trzewnej tkanki tłuszczowej, podskórnej tkanki tłuszczowej i masy mięśniowej. Może to zapewnić bardziej zniuansowaną ocenę otyłości danej osoby niż samo BMI.

      Pobieranie krwi i tkanki tłuszczowej Pobieranie krwi Podczas rekrutacji do badania przeszkolony personel pobierze do 40 ml krwi.

      Pobieranie próbek tkanki tłuszczowej od pacjentów na oddziale intensywnej terapii Tkanka tłuszczowa zostanie pobrana 5 cm bocznie od pępka w sterylnych warunkach przy użyciu strzykawki Terumo™ Luer Tip o pojemności 20 ml podłączonej do jednorazowej igły do ​​głębokiego domięśniowego Sterican 14G 80 mm, wstępnie napełnionej około 5 ml roztworu 0,9% solankowy. W każdym przebiegu biopsji pobierane jest średnio 0,3 g tkanki, zatem trzy przejścia powinny dostarczyć do 1 g tkanki tłuszczowej. Zostanie ono przefiltrowane przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy oczek 100 μm i przetransportowane do laboratorium w 15 ml wstępnie ogrzanego (370°C) Gibco™ Medium 199, roztworu Hanksa Balanced Salts.

      Pobieranie próbek tkanki tłuszczowej u pacjentów poddawanych pilnym zabiegom chirurgicznym Zespół chirurgiczny pobiera pod bezpośrednią kontrolą zarówno podskórną, jak i trzewną tkankę tłuszczową. Z każdego miejsca zostanie pobrane około 1 g tkanki. Zostanie ono przetransportowane do laboratorium w 15 ml wstępnie ogrzanego (370°C) Gibco™ Medium 199, roztworu Hanksa Balanced Salts.

      Transport próbek na Uniwersytet w Glasgow Wszystkie próbki (krew i tkanka tłuszczowa) zostaną zapakowane do transportu na Uniwersytet w Glasgow zgodnie z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi ochrony zdrowia w Szkocji.

      Przewidywany czas udziału pacjenta Cała procedura, łącznie z pobraniem krwi i pobraniem tkanki tłuszczowej, powinna zająć mniej niż 30 minut.

      Analiza tkanki tłuszczowej Z 1 g biopsji tkanki tłuszczowej można przygotować 300 µl 90% adipocytów cytokrytnych i frakcję zrębowo-naczyniową (SVF). Jeśli dostępna jest dodatkowa tkanka tłuszczowa, zostanie ona szybko zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -800°C do późniejszej analizy histologicznej.

      Dobór wielkości adipocytów zostanie przeprowadzony na nieutrwalonych świeżych zawiesinach adipocytów (5 µl) wyizolowanych poprzez trawienie kolagenazą biopsji, zobrazowanych za pomocą mikroskopu Olympus BX50 przy użyciu obiektywu x10 podłączonego do kolorowej kamery 3-CCD (JVC) w celu cyfrowego przechwytywania obrazu za pomocą automatycznego obrazu Image J. rozmiar.

      Podstawowe i stymulowane lipopolisacharydem (1 µM) wydzielanie adipokin, skorygowane pod względem liczby komórek przy użyciu stężeń DNA w zawiesinie adipocytów (izolowanych jednocześnie z RNA), będzie oceniane w izolowanych adipocytach (w dwóch powtórzeniach po 50 µl na test) po 2 godzinach w 37°C, jak opisano wcześniej (36).

      Ekspresja genu zapalenia adipocytów będzie oznaczona ilościowo w stosunku do endogennej kontroli PPIA w RNA wyizolowanym z zawiesiny adipocytów (95 µl, co daje około 500 ng RNA) przy użyciu TRIzolu (ThermoFisher Scientific). Wybrane cele zostaną wstępnie amplifikowane w RNA, po czym nastąpi oznaczenie ilościowe Taqman RT-PCR przy użyciu dostępnych w handlu zestawów sond starterów (ThermoFisher Scientific).

      Komórki SVF będą hodowane w kolbach o pojemności 25 cm2, w inkubatorze o temperaturze 37°C z 5% CO2, w pożywce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) i pobierane będą próbki po 2 i 24 godzinach w celu analizy cytokin. Hodowla (pasaż 0) będzie kontynuowana, aby umożliwić przyleganie preadipocytów, zmieniając pożywkę co 3-4 dni aż do osiągnięcia 80% konfluencji, gdy preadipocyt będzie pasażowany do 80% konfluencji (pasaż 1). Na koniec pasażu 1 preadipocyty zostaną odłączone i zamrożone w stężeniu 500 000 komórek/ml w DMEM, 20% FBS, 10% sulfotlenku dimetylu [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM L-Glutamina) i przechowywano w ciekłym azocie do późniejszej analizy różnicowania preadipocytów.

      Oznaczenie ilościowe cytokin zostanie przeprowadzone przy użyciu wielu zestawów kulek magnetycznych (Merck Millipore) w systemie MAGPIX® xPONENT 4.2 lub dostępnej w handlu metody ELISA.

      Unaczynienie i zwłóknienie tkanki tłuszczowej zostaną ocenione na dostępnych zamrożonych biopsjach osadzonych w OCT. Krioskrawki (10 µm) zostaną wybarwione immunologicznie przy użyciu anty-CD31 w celu identyfikacji naczyń krwionośnych. Gęstość naczyń krwionośnych zostanie obliczona jako stosunek liczby naczyń krwionośnych do całkowitej powierzchni przekroju. Zwłóknienie tkanki tłuszczowej będzie oceniane za pomocą czerwieni Picosirius i analizy obrazu J.

      Adipocyty będą barwione MitoTracker Green FM i MitoTracker Red, zgodnie z instrukcjami producenta i obrazowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w BHF GCRC Imaging Suite. Obrazy zostaną przeanalizowane w celu oceny morfologii mitochondriów (połączenia wzajemne, rozmiar i obrzęk) przy użyciu oprogramowania Mitomorph. Zawartość mitochondriów adipocytów będzie także oceniana po barwieniu JC-1 jako intensywność fluorescencji na komórkę w celometrze. Zawartość mitochondriów zostanie potwierdzona niezależną metodą stosunku mtDNA/DNA jądrowego przy użyciu ekspresji MT-CO2, MT-CYB, PPARG i UCP1 metodą Taqman RT-PCR.

      Rozszczepienie/fuzja mitochondriów zostanie oszacowana poprzez ilościowe określenie ekspresji genów/białek zaangażowanych w rozszczepienie mitochondriów (DNM1L) i fuzję (MFN1, MFN2 i RHOT1) przy użyciu metody Taqman RT-PCR i Western blot.

      Ekspresja genów i białek mitochondrialnego kompleksu oddechowego i białek utleniających kwasy tłuszczowe zostanie przeprowadzona odpowiednio przy użyciu metody Taqman RT-PCR i Western blot.

      Analiza próbki krwi Osocze zostanie oddzielone i zamrożone w porcjach w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Adipokiny osoczowe (np. adiponektyny, wisfatyny) będą mierzone przy użyciu komercyjnego testu ELISA, zgodnie ze standardowymi protokołami produktu.

      Postępowanie kliniczne z pacjentami objętymi badaniem W ramach tego badania nie zostaną wprowadzone żadne zmiany w postępowaniu klinicznym z pacjentami.

      Ocena bezpieczeństwa Definicje zdarzeń niepożądanych Zdarzenia niepożądane (AE) i poważne zdarzenia niepożądane (SAE) są zdefiniowane zgodnie ze słownikiem terminów Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji Dobrej Praktyki Klinicznej (ICH-GCP).

      Działania niepożądane Nakłucia igłą do pobrania krwi i tkanki tłuszczowej u większości pacjentów nie powodują poważnych problemów. Istnieje niewielkie ryzyko, że nakłucie igłą może spowodować zawroty głowy, dyskomfort, krwawienie, zasinienie lub infekcję w tym miejscu.

      Rejestrowanie i zgłaszanie zdarzeń niepożądanych Wszelkie nieprzewidziane zdarzenia medyczne u pacjenta biorącego udział w badaniu, związane z pobraniem próbek, będą rejestrowane i zgłaszane zgodnie z Ramami zarządzania badaniami (tj. corocznie w przypadku działań niepożądanych i w ciągu 15 dni w przypadku SAE). Wszelkie SAE, które są nieoczekiwane i związane z pobraniem próbki, zostaną zgłoszone Komisji ds. Etyki Badań w ciągu 15 dni od uzyskania informacji o zdarzeniu przez głównego badacza. Podsumowanie zdarzeń niepożądanych i SAE będzie co roku przekazywane Komisji ds. Etyki Badań oraz Biuru Badań i Rozwoju NHS GGC. AE i SAE będą gromadzone w formularzach opisów przypadków w okresie badania.

      Gromadzenie i zarządzanie danymi Bezpośredni dostęp do danych źródłowych/dokumentów Informacje dotyczące konkretnego pacjenta będą dostępne z elektronicznego systemu zarządzania danymi pacjenta (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) oraz z elektronicznego rekordu pacjenta na Portalu Klinicznym. Dostęp do tych systemów danych na potrzeby badania będzie ograniczony do odpowiednio delegowanych członków zespołu badawczego. Dostęp audytorów wewnętrznych lub zewnętrznych będzie zarządzany zgodnie z odpowiednimi Standardowymi Procedurami Operacyjnymi Ośrodka Badań Klinicznych w Glasgow.

      Centrum danych Wszystkie dane umożliwiające identyfikację zebrane w NHS Greater Glasgow i Clyde (NHS GGC) pozostaną w NHS GGC. Uniwersytetowi w Glasgow udostępniane będą wyłącznie zanonimizowane dane i próbki tkanek.

      Wszystkie próbki tkanek zostaną przetworzone i przeanalizowane w Szkole Zdrowia Sercowo-Naczyniowego i Metabolicznego (SCMH) Uniwersytetu w Glasgow, a nadwyżki próbek zostaną zgromadzone w banku biologicznym. Próbki tkanek znajdujące się w banku biologicznym i powiązane dane będą przechowywane i wykorzystywane zgodnie z polityką SCMH.

      Dostęp do danych Wnioski o dostęp do danych wygenerowanych w tym badaniu należy składać do głównego badacza i będą one rozpatrywane indywidualnie dla każdego przypadku i omawiane ze Sponsorem.

      Przechowywanie danych Dane będą przechowywane przez 5 lat po zakończeniu badania i pozostaną w gestii głównego badacza.

      Zapewnienie jakości W trakcie i/lub po zakończeniu badania specjaliści ds. zapewnienia jakości wyznaczeni przez NHS GGC lub organy regulacyjne mogą chcieć przeprowadzić audyty na miejscu. Od głównego badacza oczekuje się współpracy podczas każdego audytu oraz zapewnienia pomocy i dokumentacji (w tym danych źródłowych) zgodnie z żądaniem.

      Statystyki Wielkość próby Do badania zostanie włączonych ogółem 60 pacjentów, z czego 30 będzie poddawanych pilnej operacji, a 30 pacjentów zostało przyjętych na oddział intensywnej terapii. (jak opisano szczegółowo w części Projekt badania powyżej).

      Nie badano funkcji zapalnej tkanki tłuszczowej w tkance ludzkiej pacjentów z sepsą przebywających na oddziałach intensywnej terapii. Poprzednie prace wykazały istotne różnice w insulinooporności adipocytów, wydzielaniu adipokin i ekspresji genów pomiędzy pacjentkami ze stanem przedrzucawkowym a zdrową ciążą, u n=13 pacjentek w grupie (36,37). Niepublikowane dane porównujące zróżnicowanie podskórnych adipocytów między wiekiem a dopasowanym BMI mężczyznami z Europy i Azji Południowej wykazały, że wielkość efektu PPARγ wyniosła 0,72 (obliczona przy użyciu GPower). Zakładając, że badanie może wykazać podobną wielkość efektu u pacjentów z sepsą i w grupie kontrolnej, badacze wymagają, aby n=25 uczestników wykryło podobny poziom różnicy w ekspresji genów z mocą 80%. W związku z tym badacze przewidują, że n=30 pacjentów na grupę będzie wystarczające do wykazania znaczących różnic w funkcjonowaniu adipocytów w proponowanym badaniu, co pozwoli na pewne niekompletne analizy.

      Opis metod statystycznych Główny wynik zostanie przeanalizowany przy użyciu dwuczynnikowego modelu mieszanego ANOVA. Niezależnymi zmiennymi będzie obecność lub brak sepsy oraz pobrana próbka tkanki tłuszczowej (podskórnej i trzewnej). Zmienną zależną będzie ilość wydzielanej cytokiny. Badacze uwzględnią w modelu zmienne towarzyszące, o których wiadomo, że wpływają na rozmieszczenie i funkcję tkanki tłuszczowej, takie jak wiek, płeć, BMI i, jeśli to możliwe, stosunek SAT:VAT (jako miara rozmieszczenia tkanki tłuszczowej).

      W przypadku analiz, w których nie są dostępne zarówno SAT, jak i VAT, populacje zostaną porównane za pomocą testów t dla dwóch próbek, w których dane mają rozkład normalny (lub można je przekształcić, aby to osiągnąć), lub testu u Manna-Whitneya, jeśli rozkład nie jest parametryczny.

      Stosowany poziom istotności Wartość p < 0,05 będzie uznawana za istotną statystycznie. Wszystkie analizy wtórne będą miały charakter wyłącznie eksploracyjny i należy je interpretować jako generujące hipotezy.

      Etyka i zarządzanie kliniczne Zatwierdzenie etyczne Niniejszy protokół i wszelkie poprawki zostaną przedłożone Szkockiej Komisji ds. Etyki Badań Naukowych (REC), posiadającej uprawnienia do przeglądu badań wymagających zatwierdzenia zgodnie z Ustawą o osobach niepełnosprawnych (Szkocja) z 2000 r. Kopia udokumentowanej decyzji KE będzie dostępna dla sponsora i odpowiednich biur badawczo-rozwojowych (R&D) w każdym z ośrodków w celu formalnego zatwierdzenia badania. Tylko zakłady, które uzyskały aprobatę etyczną w drodze oceny specyficznej dla danego zakładu oraz zgodę kierownictwa działu badań i rozwoju, będą mogły rozpocząć badanie.

      Oświadczenie o zgodności Niniejsze badanie będzie zgodne z zasadami Ustawy o ochronie danych i Ogólnego rozporządzenia o ochronie danych (RODO), Deklaracji Helsińskiej oraz wszystkich odpowiednich wytycznych i przepisów regulujących badania kliniczne. Badacze są odpowiedzialni za przeprowadzenie badania zgodnie z zasadami wytycznych Międzynarodowej Konferencji w sprawie Harmonizacji Dobrej Praktyki Klinicznej (ICH-GCP) (www.ich.org). Wszyscy członkowie zespołu badawczego będą musieli ukończyć szkolenie GCP.

      Świadoma zgoda W pełni doceniamy bezbronność tej grupy badawczej i podjęte zostaną wszelkie wysiłki, aby chronić jej bezpieczeństwo i dobro. Zgodnie z obowiązującymi wymogami regulacyjnymi i w celu zapewnienia zgodności z ramami zarządzania badaniami, procesy wyrażania zgody zostaną ujednolicone, a w przypadku pacjentów wyrażających zgodę będzie przestrzegana solidna standardowa procedura operacyjna. Pierwszym kontaktem będzie personel kliniczny opiekujący się pacjentem.

      Poufność pacjenta Aby zachować poufność, we wszystkich formularzach opisów przypadków (CRF), raportach z badań i komunikacji dotyczącej badania pacjenci będą identyfikowani wyłącznie na podstawie przypisanego unikalnego identyfikatora badania i inicjałów. Na każdym etapie zachowana zostanie poufność pacjenta, a dane nie będą udostępniane publicznie w zakresie dozwolonym przez obowiązujące przepisy prawa i regulacje.

      Sponsoring Niniejsze badanie będzie sponsorowane przez NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.