Adiposidade e imunometabolismo na sepse (AIMS)

Hipótese A hipótese é que o tecido adiposo de pacientes gravemente enfermos com sepse apresentará mudanças na estrutura, aumento da função inflamatória e aumento da disfunção mitocondrial em comparação com pacientes controle sem sepse. Os investigadores também levantam a hipótese de que o aumento da função inflamatória será mais pronunciado no VAT do que no SAT.

Mira Os investigadores pretendem investigar diferenças potenciais na estrutura do tecido adiposo, função inflamatória e disfunção mitocondrial entre indivíduos com e sem sepse, e entre SAT e VAT.

Design de estudo

Haverá duas coortes de pacientes:

1. Pacientes submetidos a cirurgia de emergência com diagnóstico de sepse

   a. 15-30 pacientes

2. Pacientes internados em unidade de terapia intensiva com diagnóstico de sepse

   1. 15-30 pacientes

      Os resultados de pacientes com sepse serão comparados com os resultados obtidos de uma coorte de pacientes recrutados para um estudo anterior (estudo CONNECT: projeto IRAS ID 291251; referência REC 21/NS/0015). Esses pacientes são recrutados quando submetidos a uma operação abdominal eletiva, sem evidência de processo inflamatório agudo. Quando recrutados para o estudo, eles passam por um processo de coleta de gordura e sangue idêntico ao descrito neste estudo.

      Ambiente de estudo Os pacientes serão recrutados na sala de cirurgia e nas unidades de cuidados intensivos do Queen Elizabeth University Hospital Glasgow.

      Amostras de tecido adiposo serão coletadas apenas daqueles que necessitam de sedação ou anestesia geral para intubação traqueal, seja na unidade de terapia intensiva ou na sala de cirurgia.

      Consentimento Processo de consentimento Pacientes em UTI, especialmente na fase aguda da doença, muitas vezes carecem de capacidade de tomada de decisão devido ao delirium e aos efeitos dos medicamentos sedativos. Para avaliar as alterações que ocorrem no tecido adiposo durante a fase aguda da doença crítica, é importante realizar a amostragem o mais rápido possível após a admissão do paciente na UTI. Prevê-se que os pacientes recrutados na UTI neste estudo não serão capazes de consentir prospectivamente com a inscrição neste estudo. Portanto, o pesquisador buscará o consentimento de um advogado do bem-estar, do guardião do bem-estar ou de um parente mais próximo. Este pesquisador será treinado em procedimentos de consentimento que aderem aos princípios éticos da Declaração de Helsinque e da Lei de Adultos com Incapacidade (2000) na Escócia. O pesquisador fornecerá a Ficha de Informações do estudo e o Termo de Consentimento, e revisará o conteúdo para garantir que os procedimentos, benefícios e riscos do estudo sejam compreendidos. Será solicitado à pessoa abordada que dê o seu consentimento com base na sua percepção dos desejos do paciente, caso tenha capacidade. Eles serão então convidados a assinar o termo de consentimento. O original será retido no arquivo do centro do investigador, sendo uma cópia entregue à pessoa que assinou o formulário e outra cópia colocada nos prontuários médicos dos pacientes.

      Consentimento do paciente para continuar Os pacientes consentidos com o estudo por um advogado do bem-estar, guardião do bem-estar ou parente mais próximo serão abordados para obter sua permissão para continuar no estudo, uma vez que tenham recuperado a capacidade após a doença crítica. Os pacientes serão abordados por um membro da equipe de pesquisa devidamente treinado e receberá a Folha de Informações do estudo e uma cópia do formulário de Consentimento para Continuar. O pesquisador revisará o conteúdo destes com o paciente, fornecerá esclarecimentos e oportunidade para dúvidas. Os pacientes que se recusarem a participar nesta fase serão retirados do estudo.

      Saída do estudo Os participantes poderão desistir do estudo a qualquer momento sem sofrer qualquer desvantagem.

      Procedimentos do estudo Coleta de dados clínicos

      Os dados iniciais serão coletados para todos os pacientes recrutados para o estudo. Isso incluirá, mas não está limitado a:

      • Idade
      • Sexo
      • IMC
      • Principais comorbidades

      Para pacientes internados em UTI, serão coletados mais dados em relação à doença aguda. Isso incluirá, mas não está limitado a:

      • APACHE II

      • Parâmetros bioquímicos e hematológicos, quando medidos clinicamente:

        • Maior proteína C reativa nas primeiras 48 horas
        • Maior contagem de glóbulos brancos nas primeiras 48 horas
        • Maior procalcitonina nas primeiras 48 horas
        • Maior lactato nas primeiras 48 horas

      • Parâmetros fisiológicos:

        • Frequência cardíaca mais alta nas primeiras 48 horas (em batimentos por minuto)
        • Dose mais alta de noradrenalina nas primeiras 48 horas (em mcg/min)
        • Menor relação P:F nas primeiras 48 horas
        • Dose mais alta de insulina administrada nas primeiras 48 horas (em unidades/hora)

      • Dados de resultados:

        • Tempo de permanência na UTI
        • Resultado da UTI
        • Número de dias que necessitaram de ventilação mecânica invasiva
        • Número de dias que necessitaram de suporte cardiovascular
        • Número de dias que necessitaram de terapia renal substitutiva
        • Tempo de permanência hospitalar
        • Resultado hospitalar

      Coleta de dados de imagem

      Os investigadores revisarão as imagens clínicas adquiridas para cada paciente recrutado para o estudo. Qualquer paciente que tenha sido submetido a uma tomografia computadorizada, que inclua o nível vertebral L3, nos 12 meses anteriores à sua admissão na UTI, ou nas 48 horas seguintes à sua admissão, estará apto para a análise da composição corporal derivada da TC. Será obtida uma única fatia de imagem ao nível da vértebra L3. Esta imagem será então desidentificada e baixada do PACS para um computador do NHS Greater Glasgow e Clyde. A imagem desidentificada será então carregada no programa de software CoreSlicer e analisada conforme descrito anteriormente (35). Isso permitirá o cálculo da área de tecido adiposo visceral, tecido adiposo subcutâneo e massa muscular. Isto pode fornecer uma avaliação mais matizada da adiposidade de um indivíduo do que apenas o IMC.

      Amostragem de sangue e tecido adiposo Amostragem de sangue Até 40ml de sangue serão coletados por equipe treinada no recrutamento para o estudo.

      Amostragem de tecido adiposo em pacientes em uma unidade de terapia intensiva O tecido adiposo será coletado 5 cm lateralmente ao umbigo em condições estéreis usando uma seringa Terumo™ Luer Tip de 20ml anexada a uma agulha intramuscular profunda Sterican de uso único Sterican 14G 80mm pré-preenchida com aproximadamente 5ml de 0,9% salina. Cada passagem de biópsia coleta em média 0,3g de tecido, portanto três passagens devem fornecer até 1g de tecido adiposo. Este será filtrado através de um filtro de malha de náilon de 100μm e transportado para o laboratório em 15ml de Gibco™ Medium 199 pré-aquecido (370C), solução de Hanks' Balanced Salts.

      Amostragem de tecido adiposo em pacientes submetidos a cirurgia de emergência Tanto o tecido adiposo subcutâneo quanto o visceral serão coletados sob visão direta da equipe cirúrgica. Aproximadamente 1g de tecido será retirado de cada local. Este será transportado para o laboratório em 15ml de Gibco™ Medium 199 pré-aquecido (370C), solução de Hanks' Balanced Salts.

      Transporte de amostras para a Universidade de Glasgow Todas as amostras (sangue e tecido adiposo) serão embaladas para transporte para a Universidade de Glasgow de acordo com as orientações atuais da Health Protection Scotland.

      Duração esperada da participação do sujeito Todo o procedimento, incluindo coleta de sangue e coleta de gordura, deve levar menos de 30 minutos.

      Análise do tecido adiposo A partir de uma biópsia de tecido adiposo de 1g, podem ser preparados 300 µl de adipócitos com citócrito a 90% e uma fração estromovascular (SVF). Se tecido adiposo adicional estiver disponível, este será congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -800C para posterior análise histológica.

      O dimensionamento de adipócitos será realizado em suspensões de adipócitos frescos não fixados (5µL) isoladas por digestão com colagenase da biópsia, fotografadas em um microscópio Olympus BX50 usando uma lente x10 conectada a uma câmera colorida 3-CCD (JVC) para captura de imagem digital com Image J automatizado dimensionamento.

      A secreção de adipocinas estimulada por lipopolissacarídeos basais e (1µM), corrigida para o número de células usando concentrações de DNA em suspensão de adipócitos (isoladas concomitantemente com RNA), será avaliada em adipócitos isolados (em duplicata de 50µL por ensaio) após 2 horas a 37°C, conforme descrito anteriormente (36).

      A expressão do gene inflamatório de adipócitos será quantificada em relação ao controle endógeno PPIA em RNA isolado de suspensão de adipócitos (95µL, rendendo aproximadamente 500ng de RNA) usando TRIzol (ThermoFisher Scientific). Os alvos escolhidos serão pré-amplificados no RNA seguido de quantificação Taqman RT-PCR usando conjuntos de sondas iniciadoras comerciais (ThermoFisher Scientific).

      As células SVF serão cultivadas em frascos de 25 cm2, em incubadora a 37°C com 5% de CO2, em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e amostradas em 2 e 24 horas para análise de citocinas. A cultura (passagem 0) será continuada para permitir a adesão dos pré-adipócitos, trocando o meio a cada 3-4 dias até 80% confluente quando o pré-adipócito será passado até 80% confluente (passagem 1). No final da passagem, 1 pré-adipócitos serão destacados e congelados a 500.000 células/mL em DMEM, 20% de FBS, 10% de dimetilsulfóxido [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 2 mM L-Glutamina) e armazenados em nitrogênio líquido para posterior análise da diferenciação pré-adipócitos.

      A quantificação de citocinas será realizada usando matrizes múltiplas de esferas magnéticas (Merck Millipore) em um sistema MAGPIX® xPONENT 4.2 ou por ELISA comercial.

      A vascularização e fibrose do tecido adiposo serão avaliadas em biópsias congeladas disponíveis incorporadas em OCT. As criosecções (10µm) serão imunocoradas com anti-CD31 para identificação dos vasos sanguíneos. A densidade dos vasos sanguíneos será calculada como a razão entre o número de vasos sanguíneos e a área total da seção. A fibrose do tecido adiposo será avaliada usando picosirius red e análise Image J.

      Os adipócitos serão corados com MitoTracker Green FM e MitoTracker Red, de acordo com as instruções do fabricante, e fotografados usando microscopia de fluorescência no BHF GCRC Imaging Suite. As imagens serão analisadas para avaliar a morfologia mitocondrial (interconectividade, tamanho e inchaço) utilizando o software Mitomorph. O conteúdo de mitocôndrias de adipócitos também será avaliado após coloração JC-1 como intensidade de fluorescência por célula em um Cellômetro. O conteúdo mitocondrial será confirmado usando o método independente de relação mtDNA/DNA nuclear usando expressão de MT-CO2, MT-CYB, PPARG e UCP1 por Taqman RT-PCR.

      A fissão/fusão mitocondrial será estimada quantificando as expressões de genes/proteínas envolvidas na fissão mitocondrial (DNM1L) e fusão (MFN1, MFN2 e RHOT1) usando Taqman RT-PCR e western blotting.

      A expressão gênica e proteica do complexo respiratório mitocondrial e das proteínas de oxidação de ácidos graxos será realizada utilizando Taqman RT-PCR e western blotting respectivamente.

      Análise de amostra de sangue O plasma será separado e congelado em alíquotas a -80 graus Celsius. Adipocina plasmática (por ex. os níveis de adiponectina, visfatina) serão medidos usando ELISA comercial, de acordo com os protocolos padrão do produto.

      Manejo clínico dos pacientes no estudo Não haverá alterações no manejo clínico dos pacientes como parte deste estudo.

      Avaliação da segurança Definições de acontecimentos adversos Os acontecimentos adversos (EA) e os acontecimentos adversos graves (EAG) são definidos de acordo com o glossário de termos da Conferência Internacional sobre Boas Práticas Clínicas de Harmonização (ICH-GCP).

      Eventos Adversos As punções com agulha para coleta de sangue e tecido adiposo não causam problemas sérios para a maioria dos pacientes. Existe um pequeno risco de que as perfurações da agulha possam causar tonturas, desconforto, sangramento, hematomas ou infecções no local.

      Registro e notificação de eventos adversos Qualquer ocorrência médica indesejável em um paciente envolvido no estudo relacionada à coleta de amostras será registrada e relatada de acordo com a Estrutura de Governança de Pesquisa (ou seja, anualmente para EAs e dentro de 15 dias para SAEs). Qualquer SAE inesperado e relacionado à coleta da amostra será relatado ao Comitê de Ética em Pesquisa no prazo de 15 dias após o Investigador Chefe tomar conhecimento do evento. Um resumo dos EAs e SAEs será fornecido anualmente ao Comitê de Ética em Pesquisa e ao Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento, NHS GGC. Os EAs e SAEs serão coletados nos formulários de relato de caso durante o período do estudo.

      Coleta e gerenciamento de dados Acesso direto aos dados/documentos de origem As informações específicas do paciente serão acessadas no sistema eletrônico de gerenciamento de dados do paciente (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) e no registro eletrônico do paciente do Portal Clínico. O acesso a estes sistemas de dados para efeitos do estudo será limitado aos membros devidamente delegados da equipa do estudo. O acesso de auditores internos ou externos será gerenciado de acordo com os Procedimentos Operacionais Padrão relevantes do Centro de Pesquisa Clínica de Glasgow.

      Centro de dados Todos os dados identificáveis ​​coletados no NHS Greater Glasgow and Clyde (NHS GGC) permanecerão no NHS GGC. Apenas dados anonimizados e amostras de tecido serão compartilhados com a Universidade de Glasgow.

      Todas as amostras de tecido serão processadas e analisadas na Escola de Saúde Cardiovascular e Metabólica da Universidade de Glasgow (SCMH), e as amostras excedentes serão armazenadas em biobancos. As amostras de tecido bio-bancadas e os dados associados serão armazenados e utilizados de acordo com as políticas do SCMH.

      Acesso aos Dados Solicitações de acesso aos dados gerados neste estudo deverão ser feitas ao Investigador Chefe, e serão consideradas caso a caso, e serão discutidas com o Patrocinador.

      Retenção de dados Os dados serão retidos por 5 anos após a conclusão do estudo e permanecerão de responsabilidade do Investigador Chefe.

      Garantia de qualidade Durante e/ou após a conclusão do estudo, os responsáveis ​​pela garantia de qualidade nomeados pelo NHS GGC ou pelas autoridades reguladoras podem desejar realizar auditorias no local. Espera-se que o Investigador Principal coopere com qualquer auditoria e forneça assistência e documentação (incluindo dados de origem), conforme solicitado.

      Estatísticas Tamanho da amostra Um total de 60 pacientes serão recrutados, sendo 30 pacientes submetidos a cirurgia de emergência e 30 pacientes internados em unidade de terapia intensiva. (conforme detalhado em Desenho do estudo acima).

      A função inflamatória do tecido adiposo não foi examinada em tecido humano em pacientes com sepse em cuidados intensivos. Trabalhos anteriores encontraram diferenças significativas na resistência à insulina dos adipócitos, na secreção de adipocinas e na expressão genética entre pacientes com pré-eclâmpsia e gravidez saudável com n = 13 pacientes por grupo (36,37). Dados não publicados comparando a diferenciação de adipócitos subcutâneos entre idade e homens europeus e do sul da Ásia com IMC correspondente encontraram um tamanho de efeito PPARγ de 0,72 (calculado usando GPower). Supondo que o estudo possa encontrar um tamanho de efeito semelhante entre pacientes com sepse e controles, os investigadores exigem que n=25 participantes detectem um nível semelhante de diferença na expressão gênica com poder de 80%. Assim, os investigadores prevêem que n=30 pacientes por grupo serão suficientes para mostrar diferenças significativas na função dos adipócitos para o estudo proposto, permitindo algumas análises incompletas.

      Descrição dos métodos estatísticos O resultado primário será analisado usando um modelo misto ANOVA de 2 fatores. As variáveis ​​independentes serão a presença ou ausência de sepse e o depósito de tecido adiposo amostrado (subcutâneo e visceral). A variável dependente será a quantidade de citocina secretada. Os investigadores incluirão covariáveis ​​​​no modelo que são conhecidas por influenciar a distribuição e função do tecido adiposo, como idade, sexo, IMC e, quando disponível, proporção de SAT:VAT (como uma medida da distribuição do tecido adiposo).

      Para análises em que tanto o SAT como o VAT não estão disponíveis, as populações serão comparadas utilizando testes t de duas amostras onde os dados são distribuídos normalmente (ou podem ser transformados para conseguir isso) ou o teste u de Mann Whitney se distribuídos não parametricamente.

      Nível de significância a ser utilizado Um valor de p <0,05 será considerado estatisticamente significativo. Todas as análises secundárias serão puramente exploratórias e deverão ser interpretadas como geradoras de hipóteses.

      Ética e governança clínica Aprovação ética Este protocolo e quaisquer alterações serão submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa (REC) da Escócia, com autoridade para revisar estudos que requerem aprovação sob a Lei de Adultos com Incapacidade (Escócia) de 2000. Uma cópia da decisão documentada do REC estará disponível ao patrocinador e aos escritórios apropriados de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D) em cada um dos locais para aprovação formal do estudo. Somente locais que receberam aprovação ética por meio da avaliação específica do local e aprovação da gestão de P&D poderão iniciar o estudo.

      Declaração de conformidade Este estudo aderirá aos princípios da Lei de Proteção de Dados e do Regulamento Geral de Proteção de Dados (GDPR), da Declaração de Helsinque e de todas as diretrizes e legislação relevantes que regem a pesquisa clínica. Os investigadores são responsáveis ​​pela condução do estudo de acordo com os princípios das diretrizes da Conferência Internacional sobre Boas Práticas Clínicas de Harmonização (ICH-GCP) (www.ich.org). Todos os membros da equipe de estudo deverão ter concluído o treinamento em GCP.

      Consentimento informado A vulnerabilidade deste grupo de estudo é totalmente reconhecida e todos os esforços serão empreendidos para proteger a sua segurança e bem-estar. Em linha com os requisitos regulamentares aplicáveis ​​e para cumprir o Quadro de Governação da Investigação, os processos de consentimento serão padronizados e será respeitado um Procedimento Operacional Padrão robusto para pacientes que consentem. O primeiro contato será pela equipe clínica que cuida do paciente.

      Confidencialidade do paciente Para manter a confidencialidade, todos os formulários de relato de caso (CRFs), relatórios de estudo e comunicações relacionadas ao estudo identificarão os pacientes apenas pelo identificador exclusivo do estudo e pelas iniciais. A confidencialidade do paciente será mantida em todas as fases e os dados não serão disponibilizados publicamente na medida permitida pelas leis e regulamentos aplicáveis.

      Patrocínio Este estudo será patrocinado pela NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.