Adipositas und Immunmetabolismus bei Sepsis (AIMS)

Hypothese Die Hypothese ist, dass Fettgewebe von Patienten, die kritisch an Sepsis leiden, im Vergleich zu Kontrollpatienten ohne Sepsis Veränderungen in der Struktur, eine erhöhte Entzündungsfunktion und eine erhöhte mitochondriale Dysfunktion aufweisen wird. Die Forscher gehen auch davon aus, dass diese erhöhte Entzündungsfunktion bei der Mehrwertsteuer stärker ausgeprägt sein wird als bei der SAT.

Ziele Ziel der Forscher ist es, mögliche Unterschiede in der Struktur des Fettgewebes, der Entzündungsfunktion und der mitochondrialen Dysfunktion zwischen Personen mit und ohne Sepsis sowie zwischen SAT und Mehrwertsteuer zu untersuchen.

Studiendesign

Es wird zwei Patientenkohorten geben:

1. Patienten, die sich einer Notoperation mit der Diagnose Sepsis unterziehen

   A. 15-30 Patienten

2. Patienten, die mit der Diagnose Sepsis auf eine Intensivstation eingeliefert werden

   1. 15-30 Patienten

      Ergebnisse von Patienten mit Sepsis werden mit Ergebnissen einer Kohorte von Patienten verglichen, die für eine frühere Studie rekrutiert wurden (CONNECT-Studie: IRAS-Projekt-ID 291251; REC-Referenz 21/NS/0015). Diese Patienten werden rekrutiert, wenn sie sich einer elektiven Bauchoperation unterziehen, ohne dass Hinweise auf einen akuten Entzündungsprozess vorliegen. Wenn sie für die Studie rekrutiert werden, durchlaufen sie einen Fett- und Blutentnahmeprozess, der mit dem in dieser Studie beschriebenen identisch ist.

      Patienten im Studiensetting werden aus dem Operationssaal und den Intensivstationen des Queen Elizabeth University Hospital Glasgow rekrutiert.

      Fettgewebeproben werden nur von Personen entnommen, die für die Trachealintubation eine Sedierung oder Vollnarkose benötigen, entweder auf der Intensivstation oder im Operationssaal.

      Einwilligung Einwilligungsprozess Patienten auf Intensivstationen, insbesondere in der akuten Phase ihrer Erkrankung, sind aufgrund von Delir und der Wirkung sedierender Medikamente häufig nicht entscheidungsfähig. Um die Veränderungen im Fettgewebe während der akuten Phase einer kritischen Erkrankung beurteilen zu können, ist es wichtig, die Probenentnahme so bald wie möglich nach der Aufnahme eines Patienten auf eine Intensivstation durchzuführen. Es wird davon ausgegangen, dass die in dieser Studie auf der Intensivstation rekrutierten Patienten nicht in der Lage sein werden, der Aufnahme in diese Studie prospektiv zuzustimmen. Daher wird ein Forscher die Zustimmung eines Sozialanwalts, eines Sozialfürsorgers oder eines nächsten Verwandten einholen. Dieser Forscher wird in Einwilligungsverfahren geschult, die den ethischen Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und dem Gesetz über Erwachsene mit Behinderung (2000) Schottland entsprechen. Der Forscher stellt das Studieninformationsblatt und das Einverständnisformular zur Verfügung und überprüft den Inhalt, um sicherzustellen, dass die Verfahren, Vorteile und Risiken der Studie verstanden werden. Die angesprochene Person wird gebeten, ihr Einverständnis auf der Grundlage ihrer Wahrnehmung der Wünsche des Patienten zu geben, wenn sie dazu urteilsfähig ist. Anschließend werden sie aufgefordert, die Einverständniserklärung zu unterzeichnen. Das Original wird in der Akte des Prüfarztes aufbewahrt, eine Kopie wird der Person ausgehändigt, die das Formular unterzeichnet hat, und eine weitere Kopie wird in die Krankenakte des Patienten aufgenommen.

      Einverständnis des Patienten zur Fortsetzung der Studie. Patienten, die von einem Sozialanwalt, einem Vormund oder einem nächsten Verwandten in die Studie eingewilligt haben, werden kontaktiert, um ihre Erlaubnis zur Fortsetzung der Studie einzuholen, sobald sie nach ihrer schweren Erkrankung wieder handlungsfähig sind. Die Patienten werden von einem entsprechend geschulten Mitglied des Forschungsteams angesprochen und erhalten das Informationsblatt zur Studie sowie eine Kopie des Formulars „Einwilligung zur Fortsetzung“. Der Forscher bespricht die Inhalte mit dem Patienten, sorgt für Aufklärung und bietet Gelegenheit für Fragen. Patienten, die zu diesem Zeitpunkt die Teilnahme verweigern, werden aus der Studie ausgeschlossen.

      Rücktritt von der Studie: Teilnehmer können jederzeit aus der Studie austreten, ohne dass ihnen daraus Nachteile entstehen.

      Studienverfahren. Klinische Datenerfassung

      Für alle für die Studie rekrutierten Patienten werden Basisdaten erhoben. Dazu gehören unter anderem:

      • Alter
      • Sex
      • BMI
      • Schwerwiegende Komorbiditäten

      Bei Patienten, die auf einer Intensivstation aufgenommen werden, werden weitere Daten zu ihrer akuten Erkrankung erhoben. Dazu gehören unter anderem:

      • APACHE II

      • Biochemische und hämatologische Parameter, sofern klinisch gemessen:

        • Höchstes C-reaktives Protein in den ersten 48 Stunden
        • Höchste Anzahl weißer Blutkörperchen in den ersten 48 Stunden
        • Höchster Procalcitoninspiegel in den ersten 48 Stunden
        • Höchster Laktatwert in den ersten 48 Stunden

      • Physiologische Parameter:

        • Höchste Herzfrequenz in den ersten 48 Stunden (in Schlägen pro Minute)
        • Höchste Noradrenalin-Dosis in den ersten 48 Stunden (in µg/min)
        • Niedrigstes P:F-Verhältnis in den ersten 48 Stunden
        • Höchste in den ersten 48 Stunden abgegebene Insulindosis (in Einheiten/Std.)

      • Ergebnisdaten:

        • Verweildauer auf der Intensivstation
        • Ergebnis auf der Intensivstation
        • Anzahl der Tage, an denen eine invasive mechanische Beatmung erforderlich ist
        • Anzahl der Tage, an denen Herz-Kreislauf-Unterstützung erforderlich ist
        • Anzahl der Tage, an denen eine Nierenersatztherapie erforderlich ist
        • Dauer des Krankenhausaufenthalts
        • Krankenhausergebnis

      Bilddatenerfassung

      Die Prüfärzte überprüfen die klinische Bildgebung, die für jeden in die Studie aufgenommenen Patienten erstellt wurde. Jeder Patient, der sich in den 12 Monaten vor seiner Aufnahme auf eine Intensivstation oder in den 48 Stunden nach seiner Aufnahme einer CT-Untersuchung unterzogen hat, die auch die Wirbelsäule L3 umfasst, ist für eine CT-basierte Analyse der Körperzusammensetzung geeignet. Es wird ein einzelner Bildschnitt auf Höhe des L3-Wirbels angefertigt. Dieses Bild wird dann deidentifiziert und vom PACS auf einen NHS Greater Glasgow and Clyde-Computer heruntergeladen. Das nicht identifizierte Bild wird dann in das CoreSlicer-Softwareprogramm hochgeladen und wie zuvor beschrieben analysiert (35). Dies ermöglicht die Berechnung der Fläche des viszeralen Fettgewebes, des subkutanen Fettgewebes und der Muskelmasse. Dies kann eine differenziertere Beurteilung der Adipositas einer Person ermöglichen als der BMI allein.

      Blut- und Fettgewebeentnahme Blutentnahme Bis zu 40 ml Blut werden von geschultem Personal bei der Rekrutierung für die Studie entnommen.

      Fettgewebeprobenahme bei Patienten auf einer Intensivstation. Fettgewebe wird 5 cm seitlich des Nabels unter sterilen Bedingungen mit einer 20-ml-Terumo™-Spritze mit Luer-Spitze entnommen, die an einer 14G 80 mm tiefen intramuskulären Einwegnadel von Sterican befestigt ist, die mit etwa 5 ml 0,9 % vorgefüllt ist. Kochsalzlösung. Bei jedem Biopsiedurchgang werden durchschnittlich 0,3 g Gewebe entnommen, sodass drei Durchgänge bis zu 1 g Fettgewebe liefern sollten. Dieses wird durch einen 100-μm-Nylonnetzfilter gefiltert und in 15 ml vorgewärmter (370 °C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts-Lösung, ins Labor transportiert.

      Fettgewebeentnahme bei Patienten, die sich einer Notoperation unterziehen. Sowohl subkutanes als auch viszerales Fettgewebe wird vom Operationsteam unter direkter Sicht entnommen. Von jeder Stelle wird etwa 1 g Gewebe entnommen. Dies wird in 15 ml vorgewärmter (370 °C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts-Lösung, ins Labor transportiert.

      Transport der Proben zur Universität Glasgow Alle Proben (Blut und Fettgewebe) werden für den Transport zur Universität Glasgow gemäß den aktuellen Richtlinien von Health Protection Scotland verpackt.

      Voraussichtliche Dauer der Teilnahme des Probanden Der gesamte Vorgang, einschließlich Blutentnahme und Fettentnahme, sollte weniger als 30 Minuten dauern.

      Fettgewebeanalyse Aus einer 1 g Fettgewebebiopsie können 300 µl 90 % Zytokrit-Adipozyten und eine stromovaskuläre Fraktion (SVF) hergestellt werden. Wenn zusätzliches Fettgewebe verfügbar ist, wird dieses in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur späteren histologischen Analyse bei -80 °C gelagert.

      Die Größenbestimmung der Adipozyten erfolgt an unfixierten frischen Adipozytensuspensionen (5 µl), die durch Kollagenase-Verdau der Biopsie isoliert und auf einem Olympus BX50-Mikroskop unter Verwendung eines x10-Objektivs abgebildet werden, das an eine 3-CCD-Farbkamera (JVC) angeschlossen ist, zur digitalen Bilderfassung mit automatisiertem Image J Größe.

      Die durch Basal- und Lipopolysaccharide (1 µM) stimulierte Adipokin-Sekretion, korrigiert um die Zellzahl unter Verwendung von Adipozyten-Suspensions-DNA-Konzentrationen (gleichzeitig mit RNA isoliert), wird in isolierten Adipozyten (im Duplikat 50 µl pro Test) nach 2 Stunden bei 37 °C, wie zuvor beschrieben, bewertet (36).

      Die Expression entzündlicher Adipozyten-Gene wird im Verhältnis zum endogenen Kontroll-PPIA in RNA quantifiziert, die aus Adipozytensuspension (95 µl, ergibt ca. 500 ng RNA) unter Verwendung von TRIzol (ThermoFisher Scientific) isoliert wurde. Ausgewählte Ziele werden in der RNA voramplifiziert, gefolgt von einer Taqman RT-PCR-Quantifizierung unter Verwendung kommerzieller Primer-Sonden-Sets (ThermoFisher Scientific).

      SVF-Zellen werden in 25-cm2-Flaschen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert und nach 2 und 24 Stunden Proben zur Analyse von Zytokinen entnommen. Die Kultur (Passage 0) wird fortgesetzt, um die Anhaftung der Präadipozyten zu ermöglichen, wobei das Medium alle 3–4 Tage gewechselt wird, bis eine Konfluenz von 80 % vorliegt. Anschließend werden die Präadipozyten passagiert, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist (Passage 1). Am Ende der Passage werden 1 Präadipozyten abgelöst und bei 500.000 Zellen/ml in DMEM, 20 % FBS, 10 % Dimethylsulfoxid [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 2 eingefroren mM L-Glutamin) und zur späteren Analyse der Präadipozytendifferenzierung in flüssigem Stickstoff gelagert.

      Die Zytokinquantifizierung wird unter Verwendung mehrerer Magnetkügelchen-Arrays (Merck Millipore) auf einem MAGPIX® xPONENT 4.2-System oder durch kommerziellen ELISA durchgeführt.

      Die Vaskularisation und Fibrose des Fettgewebes wird anhand verfügbarer gefrorener Biopsien beurteilt, die in die OCT eingebettet sind. Kryoschnitte (10 µm) werden mit Anti-CD31 immungefärbt, um Blutgefäße zu identifizieren. Die Blutgefäßdichte wird als Verhältnis der Blutgefäßzahl zur Gesamtabschnittsfläche berechnet. Die Fibrose des Fettgewebes wird mithilfe der Picosirius-Rot- und Image-J-Analyse beurteilt.

      Adipozyten werden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit MitoTracker Green FM und MitoTracker Red gefärbt und mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie in der BHF GCRC Imaging Suite abgebildet. Die Bilder werden mithilfe der Mitomorph-Software analysiert, um die mitochondriale Morphologie (Interkonnektivität, Größe und Schwellung) zu beurteilen. Der Gehalt an Adipozyten-Mitochondrien wird auch nach der JC-1-Färbung als Fluoreszenzintensität pro Zelle in einem Cellometer bewertet. Der mitochondriale Gehalt wird mithilfe der unabhängigen Methode des mtDNA/nuklearen DNA-Verhältnisses unter Verwendung der MT-CO2-, MT-CYB-, PPARG- und UCP1-Expression durch Taqman RT-PCR bestätigt.

      Mitochondriale Spaltung/Fusion wird geschätzt, indem die Expression von Genen/Proteinen, die an der mitochondrialen Spaltung (DNM1L) und Fusion (MFN1, MFN2 und RHOT1) beteiligt sind, mithilfe von Taqman RT-PCR und Western Blot quantifiziert wird.

      Die Gen- und Proteinexpression des mitochondrialen Atmungskomplexes und der Fettsäureoxidationsproteine ​​wird mittels Taqman RT-PCR bzw. Western Blot durchgeführt.

      Blutprobenanalyse Das Plasma wird abgetrennt und in Aliquots bei -80 Grad Celsius eingefroren. Plasma-Adipokin (z. B. Adiponektin- und Visfatinspiegel werden mithilfe eines kommerziellen ELISA gemäß den Standardproduktprotokollen gemessen.

      Klinisches Management der Patienten in der Studie Im Rahmen dieser Studie wird es keine Änderungen am klinischen Management der Patienten geben.

      Bewertung der Sicherheit Definitionen unerwünschter Ereignisse Unerwünschte Ereignisse (UE) und schwerwiegende unerwünschte Ereignisse (SAE) werden gemäß dem Begriffsglossar der International Conference on Harmonization Good Clinical Practice (ICH-GCP) definiert.

      Unerwünschte Ereignisse Nadelpunktionen zur Blut- und Fettgewebeentnahme verursachen für die meisten Patienten keine ernsthaften Probleme. Es besteht ein geringes Risiko, dass Nadeleinstiche Schwindel, Unwohlsein, Blutungen, Blutergüsse oder Infektionen an der Einstichstelle verursachen können.

      Aufzeichnung und Meldung von unerwünschten Ereignissen Jedes ungünstige medizinische Vorkommnis bei einem an der Studie beteiligten Patienten im Zusammenhang mit der Probenentnahme wird gemäß dem Research Governance Framework aufgezeichnet und gemeldet (d. h. jährlich für UE und innerhalb von 15 Tagen für SUE). Alle unerwarteten SUE, die mit der Probenentnahme in Zusammenhang stehen, werden der Forschungsethikkommission innerhalb von 15 Tagen nach Kenntniserlangung des Vorfalls durch den Chefforscher gemeldet. Eine Zusammenfassung der UEs und SAEs wird dem Forschungsethikausschuss und dem Forschungs- und Entwicklungsbüro, NHS GGC, jährlich zur Verfügung gestellt. Die UEs und SAEs werden während des Studienzeitraums in den Fallberichtsformularen erfasst.

      Datenerfassung und -verwaltung Direkter Zugriff auf Quelldaten/Dokumente Der Zugriff auf patientenspezifische Informationen erfolgt über das elektronische Patientendatenverwaltungssystem (IntelliSpace Critical Care and Anaesthesia, Phillips Medical Systems) und über die elektronische Patientenakte des Clinical Portal. Der Zugriff auf diese Datensysteme zum Zweck der Studie ist auf entsprechend delegierte Mitglieder des Studienteams beschränkt. Der Zugriff durch interne oder externe Prüfer wird gemäß den relevanten Standardarbeitsanweisungen der Glasgow Clinical Research Facility verwaltet.

      Rechenzentrum Alle identifizierbaren Daten, die im NHS Greater Glasgow and Clyde (NHS GGC) erfasst werden, verbleiben im NHS GGC. Es werden nur anonymisierte Daten und Gewebeproben an die University of Glasgow weitergegeben.

      Alle Gewebeproben werden an der University of Glasgow School of Cardiocular and Metabolic Health (SCMH) verarbeitet und analysiert und überschüssige Proben werden in einer Biobank aufbewahrt. Die biobankierten Gewebeproben und zugehörigen Daten werden gemäß den Richtlinien des SCMH gespeichert und verwendet.

      Datenzugriffsanfragen für den Zugriff auf die in dieser Studie generierten Daten sollten an den leitenden Prüfarzt gerichtet werden und werden von Fall zu Fall geprüft und mit dem Sponsor besprochen.

      Datenaufbewahrung Die Daten werden nach Abschluss der Studie fünf Jahre lang aufbewahrt und verbleiben in der Verantwortung des leitenden Prüfarztes.

      Qualitätssicherung Während und/oder nach Abschluss der Studie möchten möglicherweise vom NHS GGC oder den Regulierungsbehörden benannte Qualitätssicherungsbeauftragte Audits vor Ort durchführen. Vom leitenden Prüfer wird erwartet, dass er bei jeder Prüfung kooperiert und auf Anfrage Unterstützung und Dokumentation (einschließlich Quelldaten) bereitstellt.

      Statistik Stichprobengröße Insgesamt werden 60 Patienten rekrutiert, davon 30 Patienten, die sich einer Notoperation unterziehen, und 30 Patienten, die auf eine Intensivstation eingeliefert wurden. (wie oben unter Studiendesign beschrieben).

      Die entzündliche Funktion des Fettgewebes wurde im menschlichen Gewebe bei Patienten mit Sepsis in der Intensivpflege nicht untersucht. Frühere Arbeiten fanden signifikante Unterschiede in der Insulinresistenz der Adipozyten, der Adipokinsekretion und der Genexpression zwischen Präeklampsiepatientinnen und gesunden Schwangerschaften mit n=13 Patientinnen pro Gruppe (36,37). Unveröffentlichte Daten zum Vergleich der subkutanen Adipozytendifferenzierung zwischen alters- und BMI-angepassten europäischen und südasiatischen Männern ergaben eine PPARγ-Effektgröße von 0,72 (berechnet mit GPower). Unter der Annahme, dass die Studie eine ähnliche Effektgröße zwischen Sepsis-Patienten und Kontrollpersonen feststellen könnte, benötigen die Forscher n=25 Teilnehmer, um einen ähnlichen Unterschied in der Genexpression mit einer Aussagekraft von 80 % festzustellen. Dementsprechend gehen die Forscher davon aus, dass n=30 Patienten pro Gruppe ausreichen werden, um signifikante Unterschiede in der Adipozytenfunktion für die vorgeschlagene Studie zu zeigen, was einige unvollständige Analysen zulässt.

      Beschreibung der statistischen Methoden Das primäre Ergebnis wird mithilfe eines gemischten 2-Wege-ANOVA-Modells analysiert. Unabhängige Variablen sind das Vorliegen oder Fehlen einer Sepsis und das entnommene Fettgewebedepot (subkutan und viszeral). Die abhängige Variable ist die Menge des ausgeschiedenen Zytokins. Die Forscher werden Kovariaten in das Modell einbeziehen, von denen bekannt ist, dass sie die Verteilung und Funktion des Fettgewebes beeinflussen, wie z. B. Alter, Geschlecht, BMI und, sofern verfügbar, das Verhältnis von SAT:VAT (als Maß für die Verteilung des Fettgewebes).

      Für Analysen, bei denen sowohl SAT als auch MwSt. nicht verfügbar sind, werden Populationen mithilfe von T-Tests bei zwei Stichproben verglichen, bei denen die Daten normalverteilt sind (oder transformiert werden können, um dies zu erreichen), oder des Mann-Whitney-U-Tests, wenn die Daten nichtparametrisch verteilt sind.

      Zu verwendendes Signifikanzniveau Ein p-Wert von <0,05 wird als statistisch signifikant angesehen. Alle Sekundäranalysen sind rein explorativ und sollten als hypothesengenerierend interpretiert werden.

      Ethik und klinische Governance Ethische Genehmigung Dieses Protokoll und alle Änderungen werden dem Scotland A Research Ethics Committee (REC) vorgelegt, das befugt ist, Studien zu prüfen, die gemäß dem Adults with Incapacity (Scotland) Act 2000 eine Genehmigung erfordern. Eine Kopie der dokumentierten Entscheidung des REC steht dem Sponsor und den zuständigen Forschungs- und Entwicklungsbüros (F&E) an jedem Standort zur formellen Genehmigung der Studie zur Verfügung. Nur Standorte, denen im Rahmen der standortspezifischen Bewertung eine Ethikgenehmigung und eine Genehmigung des F&E-Managements erteilt wurde, dürfen die Studie starten.

      Konformitätserklärung Diese Studie entspricht den Grundsätzen des Datenschutzgesetzes und der Datenschutz-Grundverordnung (DSGVO), der Helsinki-Erklärung sowie allen relevanten Richtlinien und Gesetzen für die klinische Forschung. Die Prüfärzte sind für die Durchführung der Studie gemäß den Grundsätzen der Richtlinien der International Conference on Harmonization Good Clinical Practice (ICH-GCP) (www.ich.org) verantwortlich. Alle Mitglieder des Studienteams müssen über eine abgeschlossene GCP-Schulung verfügen.

      Einverständniserklärung Die Verletzlichkeit dieser Studiengruppe wird voll und ganz anerkannt und es werden alle Anstrengungen unternommen, um ihre Sicherheit und ihr Wohlbefinden zu schützen. Im Einklang mit den geltenden regulatorischen Anforderungen und zur Einhaltung des Research Governance Framework werden die Einwilligungsprozesse standardisiert und eine strenge Standardarbeitsanweisung für die Einwilligung von Patienten eingehalten. Der erste Kontakt erfolgt durch das klinische Personal, das den Patienten betreut.

      Patientenvertraulichkeit Um die Vertraulichkeit zu wahren, werden die Patienten in allen Fallberichtsformularen (CRFs), Studienberichten und Kommunikation im Zusammenhang mit der Studie nur anhand der zugewiesenen eindeutigen Studienkennung und Initialen identifiziert. Die Patientenvertraulichkeit wird in jeder Phase gewahrt und die Daten werden nicht öffentlich zugänglich gemacht, soweit dies nach den geltenden Gesetzen und Vorschriften zulässig ist.

      Sponsoring Diese Studie wird von NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation gesponsert.