Lihavuus ja immunometabolismi sepsiksessä (AIMS)

Hypoteesi Hypoteesi on, että sepsikseen kriittisesti sairaiden potilaiden rasvakudoksessa on muutoksia rakenteessa, lisääntynyt tulehdustoiminto ja lisääntynyt mitokondrioiden toimintahäiriö verrattuna verrokkipotilaisiin, joilla ei ole sepsistä. Tutkijat olettavat myös, että lisääntynyt tulehdustoiminto tulee olemaan selvempi ALV:ssa kuin SAT:ssa.

Tavoitteet Tutkijoiden tavoitteena on selvittää mahdollisia eroja rasvakudoksen rakenteessa, tulehdustoiminnassa ja mitokondrioiden toimintahäiriöissä yksilöiden välillä, joilla on sepsis ja ilman, sekä SAT:n ja VAT:n välillä.

Opintojen suunnittelu

Potilasryhmiä on kaksi:

1. Potilaat, joille tehdään hätäleikkaus ja joilla on diagnosoitu sepsis

   a. 15-30 potilasta

2. Potilaat on otettu tehohoidon osastolle sepsis-diagnoosilla

   1. 15-30 potilasta

      Sepsispotilaiden tuloksia verrataan aiempaan tutkimukseen (CONNECT-tutkimus: IRAS-projektin tunnus 291251; REC-viite 21/NS/0015) saatuihin potilaisiin. Nämä potilaat värvätään, kun heille tehdään valinnainen vatsaleikkaus, ilman merkkejä akuutista tulehdusprosessista. Kun heidät värvätään tutkimukseen, he käyvät läpi samanlaisen rasva- ja verinäytteiden oton kuin tässä tutkimuksessa kuvattu.

      Tutkimuspotilaita rekrytoidaan Glasgow'n Queen Elizabeth University Hospitalin leikkaussalista ja tehohoitoyksiköistä.

      Rasvakudosnäytteitä otetaan vain niiltä, ​​jotka tarvitsevat rauhoitusta tai yleispuudutusta henkitorven intubaatioon joko tehohoidossa tai leikkaussalissa.

      Suostumus Suostumusprosessi Tehohoidossa olevilla potilailla, erityisesti sairauden akuutissa vaiheessa, puuttuu usein päätöksentekokyky deliriumin ja rauhoittavien lääkkeiden vaikutuksen vuoksi. Kriittisen sairauden akuutin vaiheen aikana rasvakudoksessa tapahtuvien muutosten arvioimiseksi on tärkeää ottaa näytteet mahdollisimman pian potilaan teho-osastolle saapumisen jälkeen. On odotettavissa, että tähän tutkimukseen teho-osastolle rekrytoidut potilaat eivät voi antaa lupaa osallistua tähän tutkimukseen. Siksi tutkija pyytää suostumuksen hyvinvointiasianajajalta, sosiaalihuoltajan tai lähimmältä sukulaiselta. Tämä tutkija koulutetaan suostumusmenettelyihin, jotka noudattavat Helsingin julistuksen ja Skotlannin aikuisten työkyvyttömyyslain (2000) eettisiä periaatteita. Tutkija toimittaa tutkimuksen tietolomakkeen ja suostumuslomakkeen sekä käy läpi sisällön varmistaakseen, että tutkimuksen menettelytavat, hyödyt ja riskit ymmärretään. Lähetettävää henkilöä pyydetään antamaan suostumus sen perusteella, miten hän näkee potilaan toiveet, jos hänellä olisi toimintakykyä. Heitä pyydetään sitten allekirjoittamaan suostumuslomake. Alkuperäinen säilytetään tutkijan työpaikan tiedostossa ja kopio annetaan lomakkeen allekirjoittaneelle ja toinen kopio potilaan potilastietoihin.

      Potilaan suostumus jatkaa Sosiaaliasianajajan, sosiaalihuoltajan tai lähimmän sukulaisen tutkimukseen suostumusta potilasta lähestytään saadakseen luvan jatkaa tutkimusta, kun he ovat palautuneet toimintakykyistään kriittisen sairautensa jälkeen. Asianmukaisesti koulutettu tutkimusryhmän jäsen lähestyy potilasta, ja heille toimitetaan tutkimuksen tietolomake sekä kopio Consent to Continue -lomakkeesta. Tutkija käy läpi näiden sisällön potilaan kanssa, antaa selvennyksen ja mahdollisuuden kysymyksiin. Potilaat, jotka kieltäytyvät osallistumasta tässä vaiheessa, poistetaan tutkimuksesta.

      Tutkimuksesta vetäytyminen Osallistujat voivat vetäytyä tutkimuksesta milloin tahansa ilman, että siitä aiheutuu haittaa.

      Tutkimusmenettelyt Kliinisen tiedon keruu

      Perustiedot kerätään kaikista tutkimukseen rekrytoiduista potilaista. Tämä sisältää, mutta ei rajoitu niihin:

      • Ikä
      • Seksiä
      • BMI
      • Tärkeimmät liitännäissairaudet

      Teho-osastolle otetuista potilaista kerätään lisätietoja heidän akuutista sairaudestaan. Tämä sisältää, mutta ei rajoitu niihin:

      • APACHE II

      • Biokemialliset ja hematologiset parametrit kliinisesti mitattuna:

        • Korkein C-reaktiivinen proteiini ensimmäisen 48 tunnin aikana
        • Korkein valkosolujen määrä ensimmäisen 48 tunnin aikana
        • Korkein prokalsitoniini ensimmäisten 48 tunnin aikana
        • Korkein laktaatti ensimmäisten 48 tunnin aikana

      • Fysiologiset parametrit:

        • Korkein syke ensimmäisten 48 tunnin aikana (lyöntiä minuutissa)
        • Korkein noradrenaliiniannos ensimmäisten 48 tunnin aikana (mcg/min)
        • Alin P:F-suhde ensimmäisten 48 tunnin aikana
        • Suurin annettu insuliiniannos ensimmäisten 48 tunnin aikana (yksikköinä tunnissa)

      • Tulostiedot:

        • ICU oleskelun pituus
        • ICU tulos
        • Invasiivista mekaanista ventilaatiota vaativien päivien lukumäärä
        • Päivien lukumäärä, jolloin tarvitaan sydän- ja verisuonituki
        • Munuaiskorvaushoitoa vaativien päivien lukumäärä
        • Sairaalahoidon kesto
        • Sairaalan tulos

      Kuvaustietojen kerääminen

      Tutkijat tarkistavat kunkin tutkimukseen värvätyn potilaan kliinisen kuvantamisen. Jokainen potilas, jolle on tehty CT-skannaus, joka sisältää L3 nikamatason, 12 kuukauden aikana ennen tehohoitoon ottamista tai 48 tunnin kuluessa vastaanottoa, soveltuu TT-pohjaiseen kehonkoostumusanalyysiin. L3-nikaman tasolla saadaan yksi kuvaviipale. Tämän kuvan tunniste poistetaan ja ladataan PACSista NHS:n Greater Glasgow and Clyde -tietokoneeseen. Tunnistamaton kuva ladataan sitten CoreSlicer-ohjelmistoon ja analysoidaan aiemmin kuvatulla tavalla (35). Tämä mahdollistaa viskeraalisen rasvakudoksen, ihonalaisen rasvakudoksen ja lihasmassan alueen laskemisen. Tämä voi tarjota vivahteikkaamman arvion yksilön rasvaisuudesta kuin pelkkä BMI.

      Veri- ja rasvakudosnäytteenotto Verinäytteenotto Koulutettu henkilökunta ottaa enintään 40 ml verta tutkimukseen rekrytoinnin yhteydessä.

      Rasvakudosnäytteen otto tehohoidon yksikössä olevilta potilailta Rasvakudos otetaan 5 cm lateraalisesti navan kohdalta steriileissä olosuhteissa käyttämällä 20 ml:n Terumo™ Luer -kärkiruiskua, joka on kiinnitetty 14G 80 mm:n Sterican Single Use Deep Intramuscular -neulaan, joka on esitäytetty noin 5 ml:lla 0,9 %. suolaliuosta. Kuhunkin biopsiaan kerätään keskimäärin 0,3 g kudosta, joten kolmen kierron pitäisi tuottaa jopa 1 g rasvakudosta. Tämä suodatetaan 100 μm:n nylonverkkosuodattimen läpi ja kuljetetaan laboratorioon 15 ml:ssa esilämmitettyä (370 C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts -liuosta.

      Rasvakudosnäytteenotto hätäleikkauspotilailta Sekä ihonalainen että viskeraalinen rasvakudos otetaan suoran näön alle kirurgiselle tiimille. Jokaisesta kohdasta otetaan noin 1 g kudosta. Tämä kuljetetaan laboratorioon 15 ml:ssa esilämmitettyä (370C) Gibco™ Medium 199, Hanksin Balanced Salts -liuosta.

      Näytteiden kuljetus Glasgow'n yliopistoon Kaikki näytteet (veri- ja rasvakudos) pakataan kuljetettaviksi Glasgow'n yliopistoon voimassa olevan Health Protection Scotland -ohjeistuksen mukaisesti.

      Tutkittavan osallistumisen arvioitu kesto Koko toimenpide, mukaan lukien veri- ja rasvanäytteenotto, kestää alle 30 minuuttia.

      Rasvakudosanalyysi 1 g:n rasvakudosbiopsiasta voidaan valmistaa 300 µl 90 % sytokriittisiä rasvasoluja ja stromovaskulaarinen fraktio (SVF). Jos ylimääräistä rasvakudosta on saatavilla, se pikajäädytetään nestetypessä ja säilytetään -800 C:ssa myöhempää histologista analyysiä varten.

      Rasvasolujen koon määritys tehdään kiinnittämättömille tuoreille rasvasolususpensioille (5 µL), jotka on eristetty biopsian kollagenaasihajotuksella, kuvattuna Olympus BX50 -mikroskoopilla käyttämällä x10-linssiä, joka on yhdistetty 3-CCD-värikameraan (JVC) digitaalista kuvien ottamista varten Image J -automaattilla. mitoitus.

      Perus- ja lipopolysakkaridilla (1 µM) stimuloitu adipokiinieritys, joka on korjattu solujen lukumäärän suhteen käyttämällä adiposyyttisuspension DNA-pitoisuuksia (eristetty samanaikaisesti RNA:n kanssa), arvioidaan eristetyissä adiposyyteissä (kaksoiskappaleina 50 µl määritystä kohti) 2 tunnin kuluttua 37 °C:ssa, kuten aiemmin on kuvattu. (36).

      Adiposyyttien tulehduksellisen geenin ilmentyminen kvantitoidaan suhteessa endogeeniseen kontrolli-PPIA:han RNA:ssa, joka on eristetty adiposyyttisuspensiosta (95 µl, tuottaa noin 500 ng RNA:ta) käyttämällä TRIzolia (ThermoFisher Scientific). Valitut kohteet esimonistetaan RNA:ssa, mitä seuraa Taqman RT-PCR -kvantitointi käyttämällä kaupallisia alukekoetinsarjoja (ThermoFisher Scientific).

      SVF-soluja viljellään 25 cm2:n pulloissa, 37 °C:n 5 % C02-inkubaattorissa Dulbeccon modifioidussa Eagle Mediumissa (DMEM) ja niistä otetaan näytteitä 2 ja 24 tunnin kohdalla sytokiinien analysoimiseksi. Viljelyä (siirtymä 0) jatketaan, jotta esiadiposyyttien annetaan tarttua, vaihtamalla alustaa 3-4 päivän välein, kunnes se on 80 % konfluentti, kun preadiposyytti siirretään 80 %:iin konfluenttiin (passage 1). Siirron 1 lopussa esiadiposyytit irrotetaan ja jäädytetään 500 000 solua/ml DMEM:ssä, 20 % FBS:ssä, 10 % dimetyylisulfoksidissa [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/ml penisilliini-streptomysiinissä ja 2 mM L-glutamiini) ja säilytettiin nestetypessä myöhempää esiadiposyyttien erilaistumisen analysointia varten.

      Sytokiinien kvantifiointi suoritetaan käyttämällä magneettihelmikerrosryhmiä (Merck Millipore) MAGPIX® xPONENT 4.2 -järjestelmässä tai kaupallisella ELISA:lla.

      Rasvakudoksen vaskularisaatio ja fibroosi arvioidaan saatavilla olevilla pakastetuilla biopsioilla, jotka on upotettu OCT:hen. Kryosektiot (10 µm) immunovärjätään käyttämällä anti-CD31:tä verisuonten tunnistamiseksi. Verisuonten tiheys lasketaan verisuonten lukumäärän suhteessa leikkauspinta-alaan. Rasvakudoksen fibroosi arvioidaan käyttämällä picosirius red- ja Image J -analyysiä.

      Rasvasolut värjätään MitoTracker Green FM:llä ja MitoTracker Redillä valmistajan ohjeiden mukaisesti ja kuvataan käyttämällä fluoresenssimikroskopiaa BHF GCRC Imaging Suitessa. Kuvia analysoidaan mitokondrioiden morfologian (yhtenäisliitettävyys, koko ja turvotus) arvioimiseksi Mitomorph-ohjelmistolla. Rasvasolujen mitokondrioiden pitoisuus arvioidaan myös JC-1-värjäyksen jälkeen fluoresenssin intensiteetinä solua kohden Cellometerissa. Mitokondrioiden sisältö vahvistetaan käyttämällä riippumatonta mtDNA/ydin-DNA-suhteen menetelmää käyttäen MT-CO2-, MT-CYB-, PPARG- ja UCP1-ilmentymistä Taqman RT-PCR:llä.

      Mitokondrioiden fissio/fuusio arvioidaan kvantifioimalla mitokondriofissioon (DNM1L) ja fuusioon (MFN1, MFN2 ja RHOT1) osallistuvien geenien/proteiinien ilmentymät käyttämällä Taqman RT-PCR:ää ja Western blot -menetelmää.

      Mitokondrioiden hengityskompleksin ja rasvahappohapetusproteiinien geeni- ja proteiiniekspressio suoritetaan käyttäen Taqman RT-PCR:ää ja vastaavasti Western blot -menetelmää.

      Verinäyteanalyysi Plasma erotetaan ja jäädytetään erinä -80 celsiusasteessa. Plasman adipokiini (esim. adiponektiinin, visfatiini) tasot mitataan kaupallisella ELISA-menetelmällä standardituoteprotokollan mukaisesti.

      Potilaiden kliininen hoito tutkimuksessa Potilaiden kliiniseen hoitoon ei tule muutoksia osana tätä tutkimusta.

      Turvallisuuden arviointi Haittatapahtumien määritelmät Haittatapahtumat (AE) ja vakavat haittatapahtumat (SAE) määritellään kansainvälisen hyvän kliinisen käytännön harmonisointikonferenssin (ICH-GCP) termien sanaston mukaisesti.

      Haittatapahtumat Veri- ja rasvakudosnäytteiden ottamisen neulanpistot eivät aiheuta vakavia ongelmia useimmille potilaille. On olemassa pieni riski, että neulanpistot voivat aiheuttaa huimausta, epämukavuutta, verenvuotoa, mustelmia tai infektioita alueella.

      Haittavaikutusten kirjaaminen ja raportointi Kaikki tutkimukseen osallistuvan potilaan epäsuotuisat lääketieteelliset tapahtumat, jotka liittyvät näytteenottoon, kirjataan ja raportoidaan Research Governance Framework -kehyksen mukaisesti (eli vuosittain haittatapahtumien osalta ja 15 päivän kuluessa SAE:n osalta). Kaikista odottamattomista ja näytteenottoon liittyvistä SAE:stä ilmoitetaan tutkimuseettiselle toimikunnalle 15 päivän kuluessa siitä, kun päätutkija on saanut tiedon tapahtumasta. Yhteenveto AE:stä ja SAE:stä toimitetaan vuosittain tutkimuksen eettiselle komitealle ja tutkimus- ja kehitystoimistolle, NHS GGC:lle. AE ja SAE kerätään tapausraporttilomakkeille tutkimuksen aikana.

      Tiedonkeruu ja hallinta Suora pääsy lähdetietoihin/asiakirjoihin Potilaskohtaiset tiedot ovat saatavilla sähköisestä potilastietojen hallintajärjestelmästä (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) ja Clinical Portalin sähköisestä potilastietueesta. Pääsy näihin tietojärjestelmiin tutkimustarkoituksia varten on rajoitettu asianmukaisesti valtuutettuihin tutkimusryhmän jäseniin. Sisäisten tai ulkoisten tarkastajien pääsyä hallinnoidaan Glasgow Clinical Research Facilityn asiaankuuluvien vakiotoimintamenettelyjen mukaisesti.

      Palvelinkeskus Kaikki NHS Greater Glasgow and Clyden (NHS GGC) sisällä kerätyt tunnistetiedot säilyvät NHS GGC:ssä. Vain anonymisoituja tietoja ja kudosnäytteitä jaetaan Glasgow'n yliopiston kanssa.

      Kaikki kudosnäytteet käsitellään ja analysoidaan University of Glasgow School of Cardiovascular and Metabolic Healthissa (SCMH), ja ylimääräiset näytteet talletetaan biopankkiin. Biopankissa olevat kudosnäytteet ja niihin liittyvät tiedot tallennetaan ja niitä käytetään SCMH:n käytäntöjen mukaisesti.

      Tietojen käyttöoikeus Pyynnöt päästä käsiksi tässä tutkimuksessa tuotettuihin tietoihin tulee tehdä päätutkijalle, ja ne käsitellään tapauskohtaisesti ja niistä keskustellaan sponsorin kanssa.

      Tietojen säilyttäminen Tietoja säilytetään 5 vuotta tutkimuksen päättymisen jälkeen, ja ne ovat päätutkijan vastuulla.

      Laadunvarmistus Tutkimuksen aikana ja/tai sen jälkeen NHS GGC:n tai sääntelyviranomaisten nimeämät laadunvarmistusviranomaiset saattavat haluta suorittaa tarkastuksia paikan päällä. Päätutkijan odotetaan toimivan yhteistyössä kaikissa tarkastuksissa ja tarjoavan apua ja asiakirjoja (mukaan lukien lähdetiedot) pyydettäessä.

      Tilastot Otoskoko Rekrytoidaan yhteensä 60 potilasta, joista 30 on hätäleikkauksessa ja 30 tehohoitoyksikössä. (kuten on kuvattu yllä kohdassa Tutkimussuunnitelma).

      Rasvakudoksen tulehduksellista toimintaa ei ole tutkittu tehohoidossa olevilla sepsispotilailla ihmiskudoksessa. Aikaisemmissa töissä havaittiin merkittäviä eroja rasvasolujen insuliiniresistenssissä, adipokiinien erittymisessä ja geenien ilmentymisessä preeklampsiapotilaiden ja terveiden raskauksien välillä, n=13 potilasta ryhmää kohden (36,37). Julkaisemattomat tiedot, joissa verrattiin ihonalaisten adiposyyttien eroa iän ja BMI-vastaavien eurooppalaisten ja eteläaasialaisten miesten välillä, havaitsivat PPARy-vaikutuksen koon 0,72 (laskettu GPowerilla). Olettaen, että tutkimuksessa saattaisi löytyä samanlainen vaikutuskoko sepsispotilaiden ja kontrollien välillä, tutkijat vaativat n = 25 osallistujaa havaitsemaan samanlainen ero geenin ilmentymisessä 80 % teholla. Näin ollen tutkijat odottavat, että n = 30 potilasta ryhmää kohden riittää osoittamaan merkittäviä eroja rasvasolujen toiminnassa ehdotetussa tutkimuksessa, mikä mahdollistaa joidenkin epätäydellisten analyysien tekemisen.

      Tilastollisten menetelmien kuvaus Ensisijainen tulos analysoidaan käyttämällä 2-suuntaista ANOVA-sekoitusmallia. Riippumattomia muuttujia ovat sepsiksen esiintyminen tai puuttuminen ja rasvakudosvarasto, josta näytteet otetaan (ihonalainen ja viskeraalinen). Riippuva muuttuja on erittyvän sytokiinin määrä. Tutkijat sisällyttävät malliin kovariaatteja, joiden tiedetään vaikuttavan rasvakudoksen jakautumiseen ja toimintaan, kuten ikä, sukupuoli, BMI ja, mikäli saatavilla, SAT:alv-suhde (rasvakudoksen jakautumisen mittana).

      Analyyseissä, joissa sekä SAT että ALV eivät ole saatavilla, populaatioita verrataan käyttämällä kahden otoksen t-testejä, joissa tiedot ovat normaalisti jakautuneet (tai voidaan muuntaa tämän saavuttamiseksi) tai Mann Whitneyn u-testiä, jos ne eivät ole parametrisesti jakautuneita.

      Käytettävä merkitsevyystaso P-arvo <0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseväksi. Kaikki toissijaiset analyysit ovat puhtaasti tutkivia, ja ne tulisi tulkita hypoteeseja luoviksi.

      Etiikka ja kliininen hallinto Eettinen hyväksyntä Tämä protokolla ja kaikki muutokset toimitetaan Scotland A Research Ethics Committeelle (REC), jolla on valtuudet tarkastella tutkimuksia, jotka edellyttävät hyväksyntää Adults with Incapacity (Scotland) Act 2000 -lain mukaisesti. Kopio REC:n dokumentoidusta päätöksestä on sponsorin ja asianmukaisten tutkimus- ja kehitystoimistojen saatavilla kussakin toimipaikassa tutkimuksen muodollista hyväksyntää varten. Vain toimipaikat, joille on myönnetty eettinen hyväksyntä paikkakohtaisen arvioinnin ja T&K-johdon hyväksynnän kautta, voivat aloittaa tutkimuksen.

      Vaatimustenmukaisuuslausunto Tässä tutkimuksessa noudatetaan tietosuojalain ja yleisen tietosuoja-asetuksen (GDPR), Helsingin julistuksen periaatteita sekä kaikkia asiaankuuluvia kliinistä tutkimusta koskevia ohjeita ja lainsäädäntöä. Tutkijat ovat vastuussa tutkimuksen suorittamisesta kansainvälisen hyvän kliinisen käytännön harmonisointikonferenssin (ICH-GCP) ohjeiden (www.ich.org) periaatteiden mukaisesti. Kaikkien tutkimusryhmän jäsenten on suoritettava GCP-koulutus.

      Tietoinen suostumus Tämän tutkimusryhmän haavoittuvuutta arvostetaan täysin, ja heidän turvallisuutensa ja hyvinvointinsa suojelemiseksi tehdään kaikki mahdollinen. Soveltuvien säännösten mukaisesti ja tutkimuksen ohjauskehyksen noudattamiseksi suostumusprosessit standardoidaan ja potilaiden suostumusta varten noudatetaan vankkaa vakiotoimintamenettelyä. Ensimmäisen kontaktin ottaa potilasta hoitava kliininen henkilökunta.

      Potilaiden luottamuksellisuus Luottamuksellisuuden säilyttämiseksi kaikki tapausraporttilomakkeet (CRF), tutkimusraportit ja tutkimusta koskeva viestintä tunnistavat potilaat vain määritetyn yksilöllisen tutkimustunnisteen ja nimikirjaimien perusteella. Potilasluottamuksellisuus säilyy kaikissa vaiheissa, eikä tietoja anneta julkisesti saataville sovellettavien lakien ja määräysten sallimassa laajuudessa.

      Sponsorointi Tätä tutkimusta sponsoroi NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.