Adiposidad e inmunometabolismo en la sepsis (AIMS)

Hipótesis La hipótesis es que el tejido adiposo de pacientes críticamente enfermos con sepsis mostrará cambios en la estructura, aumento de la función inflamatoria y aumento de la disfunción mitocondrial en comparación con los pacientes de control sin sepsis. Los investigadores también plantean la hipótesis de que ese aumento de la función inflamatoria será más pronunciado en VAT que en SAT.

Objetivos Los investigadores tienen como objetivo investigar posibles diferencias en la estructura del tejido adiposo, la función inflamatoria y la disfunción mitocondrial entre individuos con y sin sepsis, y entre SAT y VAT.

Diseño del estudio

Habrá dos cohortes de pacientes:

1. Pacientes sometidos a cirugía de urgencia con diagnóstico de sepsis.

   a. 15-30 pacientes

2. Pacientes ingresados ​​en una unidad de cuidados críticos con diagnóstico de sepsis.

   1. 15-30 pacientes

      Los resultados de pacientes con sepsis se compararán con los resultados obtenidos de una cohorte de pacientes reclutados en un estudio anterior (estudio CONNECT: proyecto IRAS ID 291251; referencia REC 21/NS/0015). Estos pacientes son reclutados cuando se someten a una operación abdominal electiva, sin evidencia de un proceso inflamatorio agudo. Cuando se los recluta para el estudio, se someten a un proceso de muestreo de grasa y sangre idéntico al descrito en este estudio.

      Ámbito del estudio Los pacientes serán reclutados del quirófano y de las Unidades de Cuidados Críticos del Hospital Universitario Queen Elizabeth de Glasgow.

      Sólo se tomarán muestras de tejido adiposo de aquellos que requieran sedación o anestesia general para la intubación traqueal, ya sea en la unidad de cuidados críticos, o en quirófano.

      Consentimiento Proceso de consentimiento Los pacientes en la UCI, particularmente en la fase aguda de su enfermedad, a menudo carecen de capacidad para tomar decisiones debido al delirio y los efectos de los medicamentos sedantes. Para evaluar los cambios que tienen lugar en el tejido adiposo durante la fase aguda de una enfermedad crítica, es importante realizar muestreos lo antes posible después del ingreso de un paciente a una UCI. Se anticipa que los pacientes reclutados en la UCI en este estudio no podrán dar su consentimiento prospectivo para inscripción en este estudio. Por lo tanto, un investigador buscará el consentimiento de un abogado de bienestar social, un tutor de bienestar social o un familiar más cercano. Este investigador estará capacitado en procedimientos de consentimiento que se adhieran a los principios éticos de la Declaración de Helsinki y la Ley de Adultos con Incapacidad (2000) de Escocia. El investigador proporcionará la Hoja de información del estudio y el Formulario de consentimiento, y revisará el contenido para garantizar que se comprendan los procedimientos, beneficios y riesgos del estudio. Se pedirá a la persona abordada que dé su consentimiento en función de su percepción de los deseos del paciente si tuviera capacidad. Luego se les invitará a firmar el formulario de consentimiento. El original se conservará en el archivo del sitio del investigador, se entregará una copia a la persona que firmó el formulario y se colocará otra copia en los registros médicos de los pacientes.

      Consentimiento del paciente para continuar A los pacientes que hayan dado su consentimiento para el estudio por un abogado de bienestar social, un tutor de bienestar social o un familiar más cercano se les acercará para obtener su permiso para continuar en el estudio una vez que hayan recuperado su capacidad después de su enfermedad crítica. Un miembro del equipo de investigación debidamente capacitado se acercará a los pacientes y les proporcionará la Hoja de información del estudio y una copia del formulario de Consentimiento para continuar. El investigador revisará el contenido de estos con el paciente, brindará aclaraciones y una oportunidad para hacer preguntas. Los pacientes que se nieguen a participar en esta etapa serán eliminados del estudio.

      Retiro del estudio Los participantes podrán retirarse del estudio en cualquier momento sin sufrir ninguna desventaja.

      Procedimientos del estudio Recopilación de datos clínicos.

      Se recopilarán datos de referencia de todos los pacientes reclutados para el estudio. Esto incluirá, entre otros:

      • Edad
      • Sexo
      • IMC
      • Principales comorbilidades

      Para los pacientes ingresados ​​en una UCI, se recopilarán más datos con respecto a su enfermedad aguda. Esto incluirá, entre otros:

      • Apache II

      • Parámetros bioquímicos y hematológicos, medidos clínicamente:

        • Proteína C reactiva más alta en las primeras 48 horas
        • Mayor recuento de glóbulos blancos en las primeras 48 horas
        • Procalcitonina más alta en las primeras 48 horas.
        • Lactato más alto en las primeras 48 horas.

      • Parámetros fisiológicos:

        • Frecuencia cardíaca más alta en las primeras 48 horas (en latidos por minuto)
        • Dosis máxima de noradrenalina en las primeras 48 horas (en mcg/min)
        • Relación P:F ​​más baja en las primeras 48 horas
        • Dosis más alta de insulina administrada en las primeras 48 horas (en unidades/hora)

      • Datos de resultados:

        • Duración de la estancia en la UCI
        • resultado de la UCI
        • Número de días que requirieron ventilación mecánica invasiva
        • Número de días que requieren soporte cardiovascular
        • Número de días que requieren terapia de reemplazo renal
        • Duración de la estancia hospitalaria
        • Resultado hospitalario

      Recopilación de datos de imágenes

      Los investigadores revisarán las imágenes clínicas adquiridas para cada paciente reclutado en el estudio. Cualquier paciente que haya sido sometido a una tomografía computarizada, que incluya el nivel vertebral L3, en los 12 meses anteriores a su ingreso en una UCI, o en las 48 horas posteriores a su ingreso, será apto para el análisis de composición corporal derivado de la tomografía computarizada. Se obtendrá un corte de imagen única al nivel de la vértebra L3. Luego, esta imagen será anonimizada y descargada de PACS a una computadora del NHS Greater Glasgow and Clyde. Luego, la imagen no identificada se cargará en el programa de software CoreSlicer y se analizará como se describió anteriormente (35). Esto permitirá calcular el área de tejido adiposo visceral, tejido adiposo subcutáneo y masa muscular. Esto puede proporcionar una evaluación más matizada de la adiposidad de un individuo que el IMC solo.

      Muestreo de sangre y tejido adiposo Muestreo de sangre Personal capacitado recolectará hasta 40 ml de sangre en el momento del reclutamiento para el estudio.

      Muestreo de tejido adiposo en pacientes en una unidad de cuidados intensivos El tejido adiposo se tomará 5 cm lateral al ombligo en condiciones estériles utilizando una jeringa con punta Luer Terumo™ de 20 ml unida a una aguja intramuscular profunda de un solo uso Sterican de 14 G y 80 mm precargada con aproximadamente 5 ml de 0,9 %. salina. Cada pase de biopsia recoge una media de 0,3 g de tejido, por lo que tres pases deberían proporcionar hasta 1 g de tejido adiposo. Esto se filtrará a través de un filtro de malla de nailon de 100 μm y se transportará al laboratorio en 15 ml de medio Gibco ™ 199 precalentado (370 ° C), solución de sales equilibradas de Hanks.

      Muestreo de tejido adiposo en pacientes sometidos a cirugía de emergencia. El equipo quirúrgico tomará tejido adiposo tanto subcutáneo como visceral bajo visión directa. Se tomará aproximadamente 1 g de tejido de cada sitio. Esto se transportará al laboratorio en 15 ml de medio Gibco ™ 199 precalentado (370 ° C), solución de sales equilibradas de Hanks.

      Transporte de muestras a la Universidad de Glasgow Todas las muestras (sangre y tejido adiposo) se empaquetarán para su transporte a la Universidad de Glasgow de acuerdo con las directrices actuales de Health Protection Scotland.

      Duración esperada de la participación del sujeto Todo el procedimiento, incluido el muestreo de sangre y el muestreo de tejido adiposo, debe durar menos de 30 minutos.

      Análisis del tejido adiposo A partir de una biopsia de tejido adiposo de 1 g, se pueden preparar 300 µl de adipocitos con un citocrito del 90 % y una fracción estromovascular (FVS). Si hay tejido adiposo adicional disponible, se congelará instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenará a -800 ° C para su posterior análisis histológico.

      El tamaño de los adipocitos se llevará a cabo en suspensiones de adipocitos frescos no fijados (5 µL) aislados mediante digestión con colagenasa de la biopsia, fotografiados en un microscopio Olympus BX50 usando una lente x10 conectada a una cámara en color de 3 CCD (JVC) para captura de imágenes digitales con Image J automatizado dimensionamiento.

      La secreción de adipoquinas estimulada por lipopolisacáridos (1 µM), basal y corregida según el número de células utilizando concentraciones de ADN en suspensión de adipocitos (aisladas simultáneamente con ARN), se evaluará en adipocitos aislados (por duplicado, 50 µl por ensayo) después de 2 horas a 37 °C, como se describió anteriormente. (36).

      La expresión del gen inflamatorio de los adipocitos se cuantificará en relación con el PPIA de control endógeno en ARN aislado de una suspensión de adipocitos (95 µl, que produce aproximadamente 500 ng de ARN) utilizando TRIzol (ThermoFisher Scientific). Los objetivos elegidos se preamplificarán en el ARN seguido de una cuantificación por RT-PCR Taqman utilizando conjuntos de sondas cebadoras comerciales (ThermoFisher Scientific).

      Las células SVF se cultivarán en matraces de 25 cm2, en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C, en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se tomarán muestras a las 2 y 24 horas para el análisis de citocinas. El cultivo (pase 0) continuará para permitir que los preadipocitos se adhieran, cambiando el medio cada 3-4 días hasta un 80% de confluencia cuando el preadipocito se pasará hasta un 80% de confluencia (pase 1). Al final del pase 1, los preadipocitos se desprenderán y congelarán a 500.000 células/ml en DMEM, 20 % de FBS, 10 % de dimetilsulfóxido [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) y se almacenaron en nitrógeno líquido para su posterior análisis de diferenciación de preadipocitos.

      La cuantificación de citoquinas se llevará a cabo utilizando matrices múltiples de perlas magnéticas (Merck Millipore) en un sistema MAGPIX® xPONENT 4.2 o mediante ELISA comercial.

      La vascularización y la fibrosis del tejido adiposo se evaluarán en biopsias congeladas disponibles integradas en OCT. Las criosecciones (10 µm) se inmunoteñirán utilizando anti-CD31 para identificar los vasos sanguíneos. La densidad de los vasos sanguíneos se calculará como la relación entre el número de vasos sanguíneos y el área total de la sección. La fibrosis del tejido adiposo se evaluará mediante rojo picosirius y análisis de Imagen J.

      Los adipocitos se teñirán con MitoTracker Green FM y MitoTracker Red, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se tomarán imágenes mediante microscopía de fluorescencia en BHF GCRC Imaging Suite. Las imágenes se analizarán para evaluar la morfología mitocondrial (interconectividad, tamaño e hinchazón) utilizando el software Mitomorph. El contenido de mitocondrias de los adipocitos también se evaluará después de la tinción con JC-1 como intensidad de fluorescencia por célula en un celómetro. El contenido mitocondrial se confirmará utilizando el método independiente de relación ADNmt/ADN nuclear utilizando la expresión de MT-CO2, MT-CYB, PPARG y UCP1 mediante Taqman RT-PCR.

      La fisión/fusión mitocondrial se estimará cuantificando las expresiones de genes/proteínas implicadas en la fisión mitocondrial (DNM1L) y la fusión (MFN1, MFN2 y RHOT1) utilizando Taqman RT-PCR y Western Blot.

      La expresión de genes y proteínas del complejo respiratorio mitocondrial y de las proteínas de oxidación de ácidos grasos se llevará a cabo mediante Taqman RT-PCR y Western Blot, respectivamente.

      Análisis de muestras de sangre El plasma se separará y congelará en alícuotas a -80 grados Celsius. Adipocina plasmática (p. ej. Los niveles de adiponectina, visfatina) se medirán mediante ELISA comercial, según los protocolos estándar del producto.

      Manejo clínico de los pacientes en el estudio No habrá cambios en el manejo clínico de los pacientes como parte de este estudio.

      Evaluación de la seguridad Definiciones de eventos adversos Los eventos adversos (EA) y los eventos adversos graves (AAG) se definen según el glosario de términos de la Conferencia Internacional sobre Armonización de Buenas Prácticas Clínicas (ICH-GCP).

      Eventos adversos Las punciones con agujas para tomar muestras de sangre y tejido adiposo no causan ningún problema grave a la mayoría de los pacientes. Existe un pequeño riesgo de que las punciones con agujas puedan causar mareos, malestar, sangrado, hematomas o infecciones en el lugar.

      Registro y notificación de eventos adversos Cualquier acontecimiento médico adverso en un paciente involucrado en el estudio relacionado con la recolección de muestras se registrará y notificará de acuerdo con el Marco de Gobernanza de la Investigación (es decir, anualmente para los EA y dentro de los 15 días para los EAG). Cualquier SAE que sea inesperado y esté relacionado con la recolección de la muestra se informará al Comité de Ética en Investigación dentro de los 15 días posteriores a que el Investigador Jefe tenga conocimiento del evento. Anualmente se proporcionará un resumen de los EA y los EAG al Comité de Ética de la Investigación y a la Oficina de Investigación y Desarrollo del NHS GGC. Los EA y AAG se recogerán en los formularios de informe de casos durante el período del estudio.

      Recopilación y gestión de datos Acceso directo a datos/documentos de origen Se accederá a la información específica del paciente desde el sistema electrónico de gestión de datos del paciente (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) y desde el registro electrónico del paciente del Portal Clínico. El acceso a estos sistemas de datos para los fines del estudio se limitará a los miembros del equipo de estudio debidamente delegados. El acceso de los auditores internos o externos se gestionará de acuerdo con los procedimientos operativos estándar pertinentes del Centro de Investigación Clínica de Glasgow.

      Centro de datos Todos los datos identificables recopilados dentro del NHS Greater Glasgow y Clyde (NHS GGC) permanecerán dentro del NHS GGC. Solo se compartirán con la Universidad de Glasgow datos anonimizados y muestras de tejido.

      Todas las muestras de tejido se procesarán y analizarán en la Escuela de Salud Cardiovascular y Metabólica (SCMH) de la Universidad de Glasgow, y las muestras sobrantes se almacenarán en biobancos. Las muestras de tejido del biobanco y los datos asociados se almacenarán y utilizarán de acuerdo con las políticas del SCMH.

      Acceso a los datos Las solicitudes para acceder a los datos generados en este estudio deben realizarse al Investigador Jefe, se considerarán caso por caso y se discutirán con el Patrocinador.

      Retención de datos Los datos se conservarán durante 5 años después de la finalización del estudio y seguirán siendo responsabilidad del investigador jefe.

      Garantía de calidad Durante y/o después de la finalización del estudio, es posible que los funcionarios de garantía de calidad nombrados por NHS GGC o las autoridades reguladoras deseen realizar auditorías in situ. Se espera que el investigador principal coopere con cualquier auditoría y proporcione asistencia y documentación (incluidos los datos originales) según se solicite.

      Estadísticas Tamaño de la muestra Se reclutará un total de 60 pacientes, 30 pacientes sometidos a cirugía de emergencia y 30 pacientes que han sido admitidos en una unidad de cuidados intensivos. (como se detalla en Diseño del estudio más arriba).

      La función inflamatoria del tejido adiposo no se ha examinado en tejido humano en pacientes con sepsis en cuidados intensivos. Trabajos anteriores encontraron diferencias significativas en la resistencia a la insulina de los adipocitos, la secreción de adipocinas y la expresión de genes entre pacientes con preeclampsia y embarazos sanos con n = 13 pacientes por grupo (36,37). Los datos no publicados que comparan la diferenciación de adipocitos subcutáneos entre hombres europeos y del sur de Asia con IMC coincidente encontraron un tamaño del efecto de PPARγ de 0,72 (calculado utilizando GPower). Suponiendo que el estudio pueda encontrar un tamaño del efecto similar entre los pacientes con sepsis y los controles, los investigadores requieren que n = 25 participantes detecten un nivel similar de diferencia en la expresión genética con un poder del 80%. En consecuencia, los investigadores anticipan que n = 30 pacientes por grupo serán suficientes para mostrar diferencias significativas en la función de los adipocitos para el estudio propuesto, lo que permite algunos análisis incompletos.

      Descripción de los métodos estadísticos El resultado primario se analizará utilizando un modelo mixto ANOVA de 2 vías. Las variables independientes serán la presencia o ausencia de sepsis y el depósito de tejido adiposo muestreado (subcutáneo y visceral). La variable dependiente será la cantidad de citoquinas secretadas. Los investigadores incluirán covariables en el modelo que se sabe que influyen en la distribución y función del tejido adiposo, como la edad, el sexo, el IMC y, cuando esté disponible, la relación SAT:IVA (como medida de la distribución del tejido adiposo).

      Para los análisis en los que ni SAT ni VAT están disponibles, las poblaciones se compararán mediante pruebas t de dos muestras donde los datos se distribuyen normalmente (o se pueden transformar para lograrlo) o la prueba u de Mann Whitney si se distribuyen de forma no paramétrica.

      Nivel de significancia a utilizar Un valor de p <0,05 se considerará estadísticamente significativo. Todos los análisis secundarios serán puramente exploratorios y deben interpretarse como generadores de hipótesis.

      Ética y gobernanza clínica Aprobación ética Este protocolo y cualquier modificación se presentarán al Comité de Ética en Investigación (REC) de Escocia, con autoridad para revisar los estudios que requieren aprobación según la Ley de Adultos con Incapacidad (Escocia) de 2000. Una copia de la decisión documentada del REC estará disponible para el patrocinador y las oficinas de Investigación y Desarrollo (I+D) correspondientes en cada uno de los sitios para su aprobación formal del estudio. Sólo los sitios a los que se les haya otorgado aprobación ética a través de la evaluación específica del sitio y la aprobación de la gerencia de I+D podrán iniciar el estudio.

      Declaración de cumplimiento Este estudio se adherirá a los principios de la Ley de Protección de Datos y el Reglamento General de Protección de Datos (GDPR), la Declaración de Helsinki y todas las directrices y legislación pertinentes que rigen la investigación clínica. Los investigadores son responsables de la realización del estudio de acuerdo con los principios de las directrices de la Conferencia Internacional sobre Armonización de Buenas Prácticas Clínicas (ICH-GCP) (www.ich.org). Se requerirá que todos los miembros del equipo de estudio hayan completado la capacitación en GCP.

      Consentimiento informado Se aprecia plenamente la vulnerabilidad de este grupo de estudio y se harán todos los esfuerzos posibles para proteger su seguridad y bienestar. De acuerdo con los requisitos regulatorios aplicables y para cumplir con el Marco de Gobernanza de la Investigación, se estandarizarán los procesos de consentimiento y se cumplirá un Procedimiento Operativo Estándar sólido para que los pacientes den su consentimiento. El primer contacto será por parte del personal clínico que atiende al paciente.

      Confidencialidad del paciente Para mantener la confidencialidad, todos los formularios de informes de casos (CRF), informes de estudios y comunicaciones relacionadas con el estudio identificarán a los pacientes únicamente mediante el identificador único del estudio asignado y sus iniciales. Se mantendrá la confidencialidad del paciente en cada etapa y los datos no se harán públicos en la medida permitida por las leyes y regulaciones aplicables.

      Patrocinio Este estudio será patrocinado por NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.