패혈증의 비만과 면역대사 (AIMS)

가설 가설은 패혈증이 있는 중병 환자의 지방 조직이 패혈증이 없는 대조군 환자에 비해 구조 변화, 염증 기능 증가, 미토콘드리아 기능 장애 증가를 나타낼 것이라는 것입니다. 연구자들은 또한 증가된 염증 기능이 SAT보다 VAT에서 더 두드러질 것이라는 가설을 세웠습니다.

목표 연구자들은 패혈증이 있는 개인과 없는 개인, SAT와 VAT 사이의 지방 조직 구조, 염증 기능 및 미토콘드리아 기능 장애의 잠재적인 차이를 조사하는 것을 목표로 합니다.

연구 설계

두 개의 환자 코호트가 있을 것입니다:

1. 패혈증 진단을 받고 응급수술을 받고 있는 환자

   ㅏ. 15-30명의 환자

2. 패혈증 진단으로 중환자실에 입원한 환자

   1. 15-30명의 환자

      패혈증 환자의 결과는 이전 연구(CONNECT 연구: IRAS 프로젝트 ID 291251; REC 참조 21/NS/0015)에 모집된 환자 집단에서 얻은 결과와 비교됩니다. 이 환자들은 급성 염증 과정의 증거 없이 선택적 복부 수술을 받을 때 모집됩니다. 연구에 참여하게 되면, 그들은 이 연구에서 설명한 것과 동일한 지방 및 혈액 샘플링 과정을 거칩니다.

      연구 설정 환자는 Queen Elizabeth University Hospital Glasgow의 수술실 및 중환자실에서 모집됩니다.

      지방 조직 샘플은 중환자실이나 수술실에서 기관 삽관을 위해 진정제나 전신 마취가 필요한 환자에게서만 채취됩니다.

      동의 동의 프로세스 중환자실 환자, 특히 질병의 급성 단계에 있는 환자는 섬망 및 진정제 효과로 인해 의사 결정 능력이 부족한 경우가 많습니다. 중증 질환의 급성기 동안 지방 조직에서 일어나는 변화를 평가하기 위해서는 환자가 중환자실에 입원한 후 가능한 한 빨리 샘플링을 수행하는 것이 중요합니다. 본 연구에서 ICU에 모집된 환자는 본 연구 등록에 전향적으로 동의하지 못할 것으로 예상됩니다. 따라서 연구자는 복지 변호사, 복지 보호자 또는 가장 가까운 친척의 동의를 구하게 됩니다. 이 연구원은 헬싱키 선언 및 무능력 성인법(2000) 스코틀랜드의 윤리 원칙을 준수하는 동의 절차에 대한 교육을 받을 것입니다. 연구자는 연구 정보 시트와 동의서를 제공하고 내용을 검토하여 연구의 절차, 이점 및 위험이 이해되었는지 확인합니다. 접근하는 사람은 능력이 있는 경우 환자의 희망 사항에 대한 인식을 바탕으로 동의를 요청받게 됩니다. 그런 다음 동의서에 서명하도록 요청받게 됩니다. 원본은 조사 현장 파일에 보관되며 사본은 양식에 서명한 사람에게 제공되고 다른 사본은 환자의 의료 기록에 보관됩니다.

      계속하기 위한 환자 동의 복지 변호사, 복지 보호자 또는 가장 가까운 친척이 연구에 동의한 환자에게 심각한 질병 이후 능력이 회복되면 연구를 계속할 수 있는 허가를 얻기 위해 접근할 것입니다. 적절하게 교육을 받은 연구팀 구성원이 환자에게 접근하여 연구 정보 시트와 계속 동의서 사본을 제공합니다. 연구자는 환자와 함께 이러한 내용을 검토하고 설명을 제공하며 질문할 기회를 제공합니다. 이 단계에서 참여를 거부하는 환자는 연구에서 제외됩니다.

      연구 철회 참가자는 어떠한 불이익 없이 언제든지 연구를 철회할 수 있습니다.

      연구 절차 임상 데이터 수집

      연구에 모집된 모든 환자에 대한 기본 데이터가 수집됩니다. 여기에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.

      • 나이
      • 섹스
      • BMI
      • 주요 동반질환

      ICU에 입원한 환자의 경우 급성 질환과 관련하여 추가 데이터가 수집됩니다. 여기에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.

      • 아파치 II

      • 임상적으로 측정되는 생화학적 및 혈액학적 매개변수:

        • 처음 48시간 동안 가장 높은 C 반응성 단백질
        • 처음 48시간 동안 가장 높은 백혈구 수
        • 처음 48시간 동안 가장 높은 프로칼시토닌
        • 처음 48시간 동안 가장 높은 젖산염

      • 생리학적 매개변수:

        • 처음 48시간 동안의 최고 심박수(분당 심박수)
        • 처음 48시간 동안의 최고 노르아드레날린 투여량(mcg/분)
        • 처음 48시간 동안 최저 P:F 비율
        • 처음 48시간 동안 전달된 인슐린의 최고 용량(단위/시간)

      • 결과 데이터:

        • ICU 입원 기간
        • 중환자실 결과
        • 침습적 기계적 환기가 필요한 일수
        • 심혈관 지원이 필요한 일수
        • 신대체요법이 필요한 일수
        • 병원 체류 기간
        • 병원 결과

      이미징 데이터 수집

      조사관은 연구에 모집된 각 환자에 대해 획득한 임상 영상을 검토합니다. 중환자실 입원 전 12개월 또는 입원 후 48시간 동안 L3 척추 수준을 포함하는 CT 스캔을 받은 환자는 CT 유래 체성분 분석에 적합합니다. L3 척추뼈 수준의 단일 이미지 조각이 얻어집니다. 그런 다음 이 이미지는 식별되지 않고 PACS에서 NHS Greater Glasgow and Clyde 컴퓨터로 다운로드됩니다. 그런 다음 식별되지 않은 이미지는 CoreSlicer 소프트웨어 프로그램에 업로드되고 이전에 설명한 대로 분석됩니다(35). 이를 통해 내장 지방 조직, 피하 지방 조직 및 근육량의 면적을 계산할 수 있습니다. 이는 BMI 단독보다 개인의 비만도에 대한 더 미묘한 평가를 제공할 수 있습니다.

      혈액 및 지방 조직 샘플링 혈액 샘플링 연구 모집 시 훈련받은 직원이 최대 40ml의 혈액을 수집합니다.

      중환자실 환자의 지방 조직 샘플링 지방 조직은 약 5ml의 0.9%가 미리 채워진 14G 80mm Sterican 일회용 심부 근육 주사 바늘에 부착된 20ml Terumo™ Luer Tip 주사기를 사용하여 멸균 조건에서 배꼽에서 5cm 측면으로 채취됩니다. 식염. 각 생검 패스는 평균 0.3g의 조직을 수집하므로 세 번의 패스를 통해 최대 1g의 지방 조직을 제공해야 합니다. 이를 100μm 나일론 메쉬 필터를 통해 여과한 후 미리 예열된(370C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts 용액 15ml에 담아 실험실로 운반합니다.

      응급 수술을 받는 환자의 지방 조직 샘플링 피하 및 내장 지방 조직 모두 수술팀이 직접 관찰하여 채취합니다. 각 부위에서 약 1g의 조직을 채취합니다. 이는 미리 예열된(370C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts 용액 15ml에 담겨 실험실로 운반됩니다.

      글래스고 대학교로 샘플 운송 모든 샘플(혈액 및 지방 조직)은 현행 스코틀랜드 보건 보호 지침에 따라 글래스고 대학교로 운송하기 위해 포장됩니다.

      피험자 참여 예상 기간 혈액 샘플링과 지방 샘플링을 포함한 전체 절차는 30분 이내에 소요됩니다.

      지방 조직 분석 1g 지방 조직 생검에서 300μl의 90% 세포용적 지방 세포와 간질혈관 분획(SVF)을 준비할 수 있습니다. 추가 지방 조직을 사용할 수 있는 경우 이를 액체 질소로 급속 냉동하고 나중에 조직학적 분석을 위해 -800C에 보관합니다.

      지방세포 크기 측정은 생검의 콜라게나제 분해로 분리된 고정되지 않은 신선한 지방세포 현탁액(5μL)에서 수행되며, Image J를 사용한 디지털 이미지 캡처를 위해 3-CCD 컬러 카메라(JVC)에 연결된 x10 렌즈를 사용하여 Olympus BX50 현미경으로 이미지화됩니다. 사이징.

      지방세포 현탁 DNA 농도(RNA와 동시에 분리됨)를 사용하여 세포 수에 대해 보정된 기본 및 지질다당류(1μM) 자극 아디포카인 분비는 이전에 설명한 대로 37°C에서 2시간 후에 분리된 지방세포(분석당 50μL 중복)에서 평가됩니다. (36).

      지방세포 염증성 유전자 발현은 TRIzol(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 지방세포 현탁액(95μL, 약 500ng RNA 생성)에서 분리된 RNA의 내인성 대조 PPIA를 기준으로 정량화됩니다. 선택된 표적은 RNA에서 사전 증폭된 후 상업용 프라이머 프로브 세트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 Taqman RT-PCR 정량화됩니다.

      SVF 세포는 25 cm2 플라스크, 37°C 5% CO2 인큐베이터, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 배양하고 사이토카인 분석을 위해 2시간 및 24시간에 샘플링합니다. 배양(계통 0)은 지방전구세포가 부착될 수 있도록 계속되며, 전지방세포가 80% 합류(계통 1)될 때까지 80% 합류가 될 때까지 3~4일마다 배지를 변경합니다. 통로 1이 끝나면 전지방세포가 분리되어 DMEM, 20% FBS, 10% 디메틸 설폭사이드[DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2에서 500,000세포/mL로 동결됩니다. mM L-글루타민)을 첨가하고 지방전구세포 분화의 차후 분석을 위해 액체 질소에 보관했습니다.

      사이토카인 정량은 MAGPIX® xPONENT 4.2 시스템의 자기 비드 다중 어레이(Merck Millipore)를 사용하거나 상용 ELISA를 통해 수행됩니다.

      지방 조직 혈관화 및 섬유증은 OCT에 내장된 이용 가능한 냉동 생검을 통해 평가됩니다. 냉동절편(10μm)은 혈관을 식별하기 위해 항CD31을 사용하여 면역염색됩니다. 혈관 밀도는 전체 단면적에 대한 혈관 수의 비율로 계산됩니다. 지방 조직 섬유증은 picosirius red 및 Image J 분석을 사용하여 평가됩니다.

      지방세포는 제조업체의 지침에 따라 MitoTracker Green FM 및 MitoTracker Red로 염색되고 BHF GCRC Imaging Suite의 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. Mitomorph 소프트웨어를 사용하여 미토콘드리아 형태(상호 연결성, 크기 및 부종)를 평가하기 위해 이미지를 분석합니다. 지방세포 미토콘드리아 함량은 JC-1 염색 후 Cellometer의 세포당 형광 강도로 평가됩니다. 미토콘드리아 함량은 Taqman RT-PCR에 의한 MT-CO2, MT-CYB, PPARG 및 UCP1 발현을 사용하는 mtDNA/핵 DNA 비율의 독립적인 방법을 사용하여 확인됩니다.

      미토콘드리아 분열/융합은 Taqman RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 사용하여 미토콘드리아 분열(DNM1L) 및 융합(MFN1, MFN2 및 RHOT1)에 관여하는 유전자/단백질의 발현을 정량화하여 추정됩니다.

      미토콘드리아 호흡 복합체 및 지방산 산화 단백질의 유전자 및 단백질 발현은 각각 Taqman RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 사용하여 수행됩니다.

      혈액 샘플 분석 혈장은 분취량으로 분리되어 섭씨 -80도에서 냉동됩니다. 혈장 아디포카인(예: 아디포넥틴, 비스파틴) 수준은 표준 제품 프로토콜에 따라 상업용 ELISA를 사용하여 측정됩니다.

      본 연구에서 환자의 임상 관리 본 연구의 일부로 환자의 임상 관리에는 변화가 없습니다.

      안전성 평가 유해사례의 정의 유해사례(AE) 및 심각한 유해사례(SAE)는 국제조화회의 우수임상관리기준(ICH-GCP) 용어집에 따라 정의됩니다.

      부작용 혈액 및 지방 조직 샘플링을 위한 바늘 천자는 대부분의 환자에게 심각한 문제를 일으키지 않습니다. 바늘 구멍으로 인해 해당 부위에 현기증, 불편함, 출혈, 멍 또는 감염이 발생할 수 있는 약간의 위험이 있습니다.

      부작용의 기록 및 보고 시료 수집과 관련하여 연구에 참여한 환자에게 발생하는 모든 예상치 못한 의학적 사건은 연구 거버넌스 프레임워크(즉, AE의 경우 매년, SAE의 경우 15일 이내)에 따라 기록 및 보고됩니다. 예상치 못한 SAE 및 시료 수집과 관련된 모든 SAE는 최고 조사관이 사건을 인지한 후 15일 이내에 연구 윤리 위원회에 보고됩니다. AE 및 SAE에 대한 요약은 연구 윤리 위원회와 NHS GGC 연구 개발 부서에 매년 제공됩니다. AE 및 SAE는 연구 기간 동안 증례 보고서 양식에 수집됩니다.

      데이터 수집 및 관리 원본 데이터/문서에 직접 액세스 환자별 정보는 전자 환자 데이터 관리 시스템(IntelliSpace Critical Care 및 Anesthesia, Phillips Medical Systems)과 임상 포털 전자 환자 기록에서 액세스됩니다. 연구 목적으로 이러한 데이터 시스템에 대한 액세스는 적절하게 위임된 연구 팀 구성원으로 제한됩니다. 내부 또는 외부 감사자의 접근은 글래스고 임상 연구 시설의 관련 표준 운영 절차에 따라 관리됩니다.

      데이터 센터 NHS GGC(Greater Glasgow and Clyde) 내에서 수집된 모든 식별 가능한 데이터는 NHS GGC 내에 유지됩니다. 익명화된 데이터와 조직 샘플만 University of Glasgow와 공유됩니다.

      모든 조직 샘플은 글래스고 대학교 심혈관 및 대사 건강 학교(SCMH)에서 처리 및 분석되며 잉여 샘플은 바이오뱅크에 보관됩니다. 바이오뱅크 조직 샘플 및 관련 데이터는 SCMH의 정책에 따라 저장되고 사용됩니다.

      데이터 액세스 본 연구에서 생성된 데이터에 대한 액세스 요청은 최고 연구자에게 이루어져야 하며 개별 사례별로 고려되며 의뢰자와 논의됩니다.

      데이터 보존 데이터는 연구가 완료된 후 5년 동안 보관되며 수석 조사관의 책임으로 유지됩니다.

      품질 보증 연구 완료 중 및/또는 완료 후에 NHS GGC 또는 규제 당국이 지명한 품질 보증 담당자가 현장 감사를 수행할 수 있습니다. 주 조사자는 모든 감사에 협조하고 요청에 따라 지원 및 문서(원본 데이터 포함)를 제공해야 합니다.

      통계 표본 크기 응급 수술을 받는 환자 30명, 중환자실에 입원한 환자 30명 등 총 60명의 환자를 모집합니다. (위의 연구 설계에 자세히 설명되어 있음)

      지방 조직의 염증 기능은 중환자실에서 패혈증 환자의 인간 조직에서 검사되지 않았습니다. 이전 연구에서는 그룹당 n=13명의 환자를 대상으로 자간전증 환자와 건강한 임신 사이의 지방세포 인슐린 저항성, 아디포카인 분비 및 유전자 발현에 유의미한 차이가 있음을 발견했습니다(36,37). 연령과 BMI가 일치하는 유럽 및 남아시아 남성 간의 피하 지방세포 분화를 비교하는 미발표 데이터에서는 PPARγ 효과 크기가 0.72인 것으로 나타났습니다(GPower를 사용하여 계산). 연구에서 패혈증 환자와 대조군 사이에 유사한 효과 크기가 발견될 수 있다고 가정하면, 조사자는 80% 검정력으로 유전자 발현의 유사한 수준의 차이를 탐지하기 위해 n=25명의 참가자가 필요합니다. 따라서 연구자들은 그룹당 n=30명의 환자가 제안된 연구에서 지방세포 기능의 유의미한 차이를 보여주기에 충분할 것으로 예상하여 일부 불완전한 분석이 허용됩니다.

      통계 방법 설명 1차 결과는 2원 ANOVA 혼합 모델을 사용하여 분석됩니다. 독립 변수는 패혈증의 유무, 샘플링된 지방 조직 저장소(피하 및 내장)입니다. 종속 변수는 분비된 사이토카인의 양입니다. 조사관은 연령, 성별, BMI 및 가능한 경우 SAT:VAT 비율(지방 조직 분포 측정)과 같은 지방 조직 분포 및 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 공변량을 모델에 포함합니다.

      SAT와 VAT를 모두 사용할 수 없는 분석의 경우 데이터가 정규 분포(또는 이를 달성하기 위해 변환될 수 있음)인 2-표본 t-검정을 사용하거나 비모수적으로 분포된 경우 Mann Whitney u-검정을 사용하여 모집단을 비교합니다.

      사용되는 유의 수준 <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 모든 2차 분석은 순전히 탐색적이며 가설 생성으로 해석되어야 합니다.

      윤리 및 임상 거버넌스 윤리적 승인 이 프로토콜과 모든 개정안은 성인 무능력자법(스코틀랜드) 법 2000에 따라 승인이 필요한 연구를 검토할 권한이 있는 스코틀랜드 A 연구 윤리 위원회(REC)에 제출됩니다. REC의 문서화된 결정 사본은 연구의 공식 승인을 위해 스폰서 및 각 현장의 해당 연구 개발(R&D) 사무소에 제공됩니다. 현장별 평가를 통해 윤리 승인 및 R&D 관리 승인을 받은 현장만 연구를 시작할 수 있습니다.

      준수 선언문 이 연구는 데이터 보호법, 일반 데이터 보호 규정(GDPR), 헬싱키 선언, 임상 연구에 적용되는 모든 관련 지침 및 법률의 원칙을 준수합니다. 연구자들은 국제 조화 회의 우수 임상 관리 기준(ICH-GCP) 지침(www.ich.org)의 원칙에 따라 연구 수행을 책임집니다. 연구팀의 모든 구성원은 GCP 교육을 이수해야 합니다.

      사전 동의 본 연구 그룹의 취약성을 충분히 인식하고 있으며, 이들의 안전과 안녕을 보호하기 위해 모든 노력을 기울일 것입니다. 적용 가능한 규제 요구 사항에 맞춰 연구 거버넌스 프레임워크를 준수하기 위해 동의 프로세스가 표준화되고 동의 환자를 위한 강력한 표준 운영 절차가 준수됩니다. 첫 번째 접촉은 환자를 돌보는 임상 직원이 담당합니다.

      환자 기밀 유지 기밀을 유지하기 위해 모든 사례 보고서 양식(CRF), 연구 보고서 및 연구와 관련된 커뮤니케이션은 할당된 고유 연구 식별자와 이니셜만으로 환자를 식별합니다. 환자의 기밀은 모든 단계에서 유지되며 데이터는 해당 법률 및 규정에서 허용하는 한도 내에서 공개적으로 제공되지 않습니다.

      후원 이 연구는 NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation의 후원을 받습니다.