Adiposità e immunometabolismo nella sepsi (AIMS)

Ipotesi L'ipotesi è che il tessuto adiposo dei pazienti critici con sepsi mostrerà cambiamenti nella struttura, un aumento della funzione infiammatoria e un aumento della disfunzione mitocondriale rispetto ai pazienti di controllo senza sepsi. I ricercatori ipotizzano inoltre che tale aumento della funzione infiammatoria sarà più pronunciato nel VAT che nel SAT.

Obiettivi I ricercatori mirano a indagare le potenziali differenze nella struttura del tessuto adiposo, nella funzione infiammatoria e nella disfunzione mitocondriale tra individui con e senza sepsi e tra SAT e VAT.

Progettazione dello studio

Ci saranno due gruppi di pazienti:

1. Pazienti sottoposti a intervento chirurgico d'urgenza con diagnosi di sepsi

   UN. 15-30 pazienti

2. Pazienti ricoverati in un'unità di terapia intensiva con una diagnosi di sepsi

   1. 15-30 pazienti

      I risultati dei pazienti con sepsi verranno confrontati con i risultati ottenuti da una coorte di pazienti reclutati in uno studio precedente (studio CONNECT: progetto IRAS ID 291251; riferimento REC 21/NS/0015). Questi pazienti vengono reclutati quando sottoposti ad un intervento addominale elettivo, senza evidenza di un processo infiammatorio acuto. Una volta reclutati per lo studio, vengono sottoposti a un processo di prelievo di grasso e sangue identico a quello descritto in questo studio.

      Impostazione dello studio I pazienti verranno reclutati dalla sala operatoria e dalle unità di terapia intensiva presso il Queen Elizabeth University Hospital di Glasgow.

      I campioni di tessuto adiposo verranno prelevati solo da coloro che necessitano di sedazione o anestesia generale per intubazione tracheale, sia nell'unità di terapia intensiva che in sala operatoria.

      Consenso Processo di consenso I pazienti in terapia intensiva, soprattutto nella fase acuta della malattia, spesso non hanno capacità decisionale a causa del delirio e degli effetti dei farmaci sedativi. Per valutare i cambiamenti che avvengono nel tessuto adiposo durante la fase acuta di una malattia critica, è importante effettuare il campionamento il prima possibile dopo il ricovero del paziente in terapia intensiva. Si prevede che i pazienti reclutati in terapia intensiva in questo studio non saranno in grado di acconsentire in modo prospettico all'arruolamento in questo studio. Pertanto, un ricercatore chiederà il consenso a un avvocato del Welfare, a un tutore del Welfare o a un parente più prossimo. Questo ricercatore sarà formato nelle procedure di consenso che aderiscono ai principi etici della Dichiarazione di Helsinki e della Legge sugli adulti con incapacità (2000) Scozia. Il ricercatore fornirà la scheda informativa dello studio e il modulo di consenso ed esaminerà i contenuti per garantire che le procedure, i benefici e i rischi dello studio siano compresi. Alla persona avvicinata verrà chiesto di dare il proprio consenso in base alla sua percezione dei desideri del paziente, se ne avesse la capacità. Saranno poi invitati a firmare il modulo di consenso. L'originale sarà conservato nella cartella clinica dello sperimentatore, una copia sarà consegnata alla persona che ha firmato il modulo e un'altra copia sarà inserita nella cartella clinica del paziente.

      Consenso del paziente a continuare I pazienti che hanno acconsentito allo studio da un avvocato del Welfare, un tutore del Welfare o un parente più prossimo verranno contattati per ottenere il loro permesso di continuare lo studio una volta che avranno recuperato la capacità dopo la loro malattia critica. I pazienti verranno avvicinati da un membro adeguatamente formato del gruppo di ricerca e riceveranno il foglio informativo dello studio e una copia del modulo di consenso alla continuazione. Il ricercatore ne esaminerà il contenuto con il paziente, fornirà chiarimenti e un'opportunità per porre domande. I pazienti che rifiutano di partecipare in questa fase verranno rimossi dallo studio.

      Ritiro dallo studio I partecipanti possono ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento senza subire alcuno svantaggio.

      Procedure dello studio Raccolta dati clinici

      I dati di base verranno raccolti per tutti i pazienti reclutati nello studio. Ciò includerà, ma non è limitato a:

      • Età
      • Sesso
      • BMI
      • Principali comorbilità

      Per i pazienti ricoverati in terapia intensiva verranno raccolti ulteriori dati relativi alla loro malattia acuta. Ciò includerà, ma non è limitato a:

      • APACHE II

      • Parametri biochimici ed ematologici, se misurati clinicamente:

        • Massima proteina C-reattiva nelle prime 48 ore
        • Conta più alta di globuli bianchi nelle prime 48 ore
        • Procalcitonina più alta nelle prime 48 ore
        • Lattato più alto nelle prime 48 ore

      • Parametri fisiologici:

        • Frequenza cardiaca più alta nelle prime 48 ore (in battiti al minuto)
        • Dose massima di noradrenalina nelle prime 48 ore (in mcg/min)
        • Rapporto P:F più basso nelle prime 48 ore
        • Dose più alta di insulina erogata nelle prime 48 ore (in unità/ora)

      • Dati sui risultati:

        • Durata del ricovero in terapia intensiva
        • Esito della terapia intensiva
        • Numero di giorni che richiedono ventilazione meccanica invasiva
        • Numero di giorni che richiedono supporto cardiovascolare
        • Numero di giorni che necessitano di terapia sostitutiva renale
        • Durata della degenza in ospedale
        • Esito ospedaliero

      Raccolta dati di imaging

      I ricercatori esamineranno l'imaging clinico acquisito per ciascun paziente reclutato nello studio. Qualsiasi paziente che sia stato sottoposto a una TAC, che include il livello vertebrale L3, nei 12 mesi precedenti il ​​ricovero in terapia intensiva, o nelle 48 ore successive al ricovero, sarà idoneo all'analisi della composizione corporea derivata dalla TC. Verrà ottenuta una singola fetta di immagine a livello della vertebra L3. Questa immagine verrà quindi deidentificata e scaricata dal PACS su un computer NHS Greater Glasgow e Clyde. L'immagine deidentificata verrà quindi caricata nel programma software CoreSlicer e analizzata come descritto in precedenza (35). Ciò consentirà il calcolo dell'area del tessuto adiposo viscerale, del tessuto adiposo sottocutaneo e della massa muscolare. Ciò può fornire una valutazione più sfumata dell’adiposità di un individuo rispetto al solo BMI.

      Campionamento di sangue e tessuto adiposo Prelievo di sangue Fino a 40 ml di sangue verranno raccolti da personale addestrato al momento del reclutamento per lo studio.

      Campionamento di tessuto adiposo in pazienti in un'unità di terapia intensiva Il tessuto adiposo verrà prelevato 5 cm lateralmente all'ombelico in condizioni sterili utilizzando una siringa Terumo™ Luer Tip da 20 ml collegata a un ago intramuscolare profondo Sterican monouso da 80 mm 14G preriempito con circa 5 ml di 0,9% salino. Ciascun passaggio bioptico raccoglie in media 0,3 g di tessuto, quindi tre passaggi dovrebbero fornire fino a 1 g di tessuto adiposo. Questo verrà filtrato attraverso un filtro a rete di nylon da 100 μm e trasportato al laboratorio in 15 ml di Gibco™ Medium 199 preriscaldato (370°C), soluzione di sali bilanciati di Hanks.

      Campionamento del tessuto adiposo in pazienti sottoposti a intervento chirurgico d'urgenza Sia il tessuto adiposo sottocutaneo che quello viscerale verranno prelevati sotto visione diretta dall'équipe chirurgica. Da ciascun sito verrà prelevato circa 1 g di tessuto. Questo verrà trasportato al laboratorio in 15 ml di Gibco™ Medium 199 preriscaldato (370°C), soluzione di sali bilanciati di Hanks.

      Trasporto dei campioni all'Università di Glasgow Tutti i campioni (sangue e tessuto adiposo) saranno imballati per il trasporto all'Università di Glasgow in conformità con le attuali linee guida di Health Protection Scotland.

      Durata prevista della partecipazione del soggetto L'intera procedura, compreso il prelievo di sangue e il prelievo di tessuto adiposo, dovrebbe richiedere meno di 30 minuti.

      Analisi del tessuto adiposo Da una biopsia di 1 g di tessuto adiposo è possibile preparare 300 µl di adipociti con citocrito al 90% e una frazione stromovascolare (SVF). Se è disponibile ulteriore tessuto adiposo, questo verrà congelato rapidamente in azoto liquido e conservato a -800°C per la successiva analisi istologica.

      Il dimensionamento degli adipociti sarà effettuato su sospensioni di adipociti freschi non fissati (5μL) isolate mediante digestione con collagenasi della biopsia, riprese su un microscopio Olympus BX50 utilizzando una lente x10 collegata a una fotocamera a colori 3-CCD (JVC) per l'acquisizione di immagini digitali con Image J automatizzato dimensionamento.

      La secrezione di adipochine stimolata basale e lipopolisaccaride (1μM), corretta per il numero di cellule utilizzando le concentrazioni di DNA in sospensione di adipociti (isolato contemporaneamente all'RNA), sarà valutata in adipociti isolati (in duplicato 50μL per test) dopo 2 ore a 37°C, come descritto in precedenza (36).

      L'espressione genica infiammatoria degli adipociti sarà quantificata rispetto al controllo endogeno PPIA nell'RNA isolato dalla sospensione degli adipociti (95μL, producendo circa 500 ng di RNA) utilizzando TRIzol (ThermoFisher Scientific). I target scelti verranno pre-amplificati nell'RNA seguiti dalla quantificazione Taqman RT-PCR utilizzando set di sonde primer commerciali (ThermoFisher Scientific).

      Le cellule SVF verranno coltivate in fiasche da 25 cm2, in un incubatore a 37°C con CO2 al 5%, in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) e campionate a 2 e 24 ore per l'analisi delle citochine. La coltura (passaggio 0) verrà continuata per consentire ai pre-adipociti di aderire, cambiando terreno ogni 3-4 giorni fino all'80% di confluente, dopodiché i pre-adipociti verranno fatti passare fino all'80% di confluente (passaggio 1). Alla fine del passaggio 1 pre-adipociti verranno staccati e congelati a 500.000 cellule/mL in DMEM, 20% FBS, 10% dimetilsolfossido [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/mL penicillina-streptomicina e 2 mM L-Glutammina) e conservati in azoto liquido per la successiva analisi della differenziazione dei pre-adipociti.

      La quantificazione delle citochine sarà effettuata utilizzando array multipli di sfere magnetiche (Merck Millipore) su un sistema MAGPIX® xPONENT 4.2 o mediante ELISA commerciale.

      La vascolarizzazione e la fibrosi del tessuto adiposo saranno valutate sulle biopsie congelate disponibili incluse nell'OCT. Le criosezioni (10μm) saranno immunocolorate utilizzando l'anti-CD31 per identificare i vasi sanguigni. La densità dei vasi sanguigni verrà calcolata come rapporto tra il numero dei vasi sanguigni e l'area totale della sezione. La fibrosi del tessuto adiposo sarà valutata utilizzando l'analisi del rosso picosirio e dell'immagine J.

      Gli adipociti verranno colorati con MitoTracker Green FM e MitoTracker Red, secondo le istruzioni del produttore, e acquisiti utilizzando la microscopia a fluorescenza nella BHF GCRC Imaging Suite. Le immagini verranno analizzate per valutare la morfologia mitocondriale (interconnettività, dimensione e rigonfiamento) utilizzando il software Mitomorph. Il contenuto dei mitocondri degli adipociti sarà valutato anche dopo la colorazione con JC-1 come intensità di fluorescenza per cellula in un cellometro. Il contenuto mitocondriale sarà confermato utilizzando il metodo indipendente del rapporto mtDNA/DNA nucleare utilizzando l'espressione di MT-CO2, MT-CYB, PPARG e UCP1 mediante Taqman RT-PCR.

      La fissione/fusione mitocondriale sarà stimata quantificando l'espressione di geni/proteine ​​coinvolte nella fissione/fusione mitocondriale (DNM1L) e nella fusione (MFN1, MFN2 e RHOT1) utilizzando Taqman RT-PCR e western blotting.

      L'espressione genica e proteica del complesso respiratorio mitocondriale e delle proteine ​​di ossidazione degli acidi grassi sarà effettuata rispettivamente utilizzando Taqman RT-PCR e western blotting.

      Analisi dei campioni di sangue Il plasma verrà separato e congelato in aliquote a -80 gradi Celsius. Adipochine plasmatiche (ad es. i livelli di adiponectina, visfatina) saranno misurati utilizzando ELISA commerciale, come da protocolli standard del prodotto.

      Gestione clinica dei pazienti nello studio Non saranno apportate modifiche alla gestione clinica dei pazienti nell'ambito di questo studio.

      Valutazione della sicurezza Definizioni degli eventi avversi Gli eventi avversi (EA) e gli eventi avversi gravi (SAE) sono definiti secondo il glossario dei termini della Conferenza internazionale sull'armonizzazione delle buone pratiche cliniche (ICH-GCP).

      Eventi avversi Le punture con ago per il prelievo di sangue e tessuto adiposo non causano problemi seri per la maggior parte dei pazienti. Esiste un piccolo rischio che le punture con ago possano causare vertigini, disagio, sanguinamento, lividi o infezioni nel sito.

      Registrazione e segnalazione di eventi avversi Qualsiasi evento medico sfavorevole in un paziente coinvolto nello studio correlato alla raccolta dei campioni sarà registrato e segnalato in conformità con il quadro di governance della ricerca (ovvero annualmente per gli EA ed entro 15 giorni per i SAE). Qualsiasi SAE inaspettato e correlato alla raccolta del campione sarà segnalato al Comitato Etico della Ricerca entro 15 giorni dal momento in cui il Capo Investigatore viene a conoscenza dell'evento. Una sintesi degli EA e dei SAE sarà fornita annualmente al Comitato etico della ricerca e all'Ufficio ricerca e sviluppo, NHS GGC. Gli EA e i SAE verranno raccolti nei moduli di segnalazione dei casi durante il periodo dello studio.

      Raccolta e gestione dei dati Accesso diretto ai dati/documenti di origine. Le informazioni specifiche del paziente saranno accessibili dal sistema elettronico di gestione dei dati del paziente (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) e dalla cartella clinica elettronica del portale clinico. L'accesso a questi sistemi di dati ai fini dello studio sarà limitato ai membri opportunamente delegati del gruppo di studio. L'accesso da parte di revisori interni o esterni sarà gestito in conformità con le pertinenti procedure operative standard del Glasgow Clinical Research Facility.

      Centro dati Tutti i dati identificabili raccolti all'interno dell'NHS Greater Glasgow and Clyde (NHS GGC) rimarranno all'interno dell'NHS GGC. Solo i dati e i campioni di tessuto resi anonimi saranno condivisi con l’Università di Glasgow.

      Tutti i campioni di tessuto verranno elaborati e analizzati presso la Scuola di salute cardiovascolare e metabolica (SCMH) dell'Università di Glasgow e i campioni in eccesso verranno conservati nella biobanche. I campioni di tessuto della biobanche e i dati associati verranno archiviati e utilizzati in conformità con le politiche dell'SCMH.

      Accesso ai dati Le richieste di accesso ai dati generati in questo studio devono essere presentate al ricercatore capo e saranno considerate caso per caso e discusse con lo Sponsor.

      Conservazione dei dati I dati verranno conservati per 5 anni dopo il completamento dello studio e rimarranno di responsabilità del ricercatore capo.

      Garanzia di qualità Durante e/o dopo il completamento dello studio, i funzionari di garanzia della qualità nominati da NHS GGC o dalle autorità di regolamentazione potrebbero voler eseguire audit in loco. Il ricercatore principale dovrà collaborare con qualsiasi audit e fornire assistenza e documentazione (compresi i dati di origine) come richiesto.

      Statistiche Dimensione del campione Verranno reclutati un totale di 60 pazienti, di cui 30 pazienti sottoposti a intervento chirurgico d'urgenza e 30 pazienti che sono stati ricoverati in un'unità di terapia intensiva. (come dettagliato nella sezione Progettazione dello studio di cui sopra).

      La funzione infiammatoria del tessuto adiposo non è stata esaminata nel tessuto umano in pazienti con sepsi in terapia intensiva. Un lavoro precedente ha rilevato differenze significative nella resistenza all'insulina degli adipociti, nella secrezione di adipochine e nell'espressione genica tra pazienti con pre-eclampsia e gravidanze sane con n = 13 pazienti per gruppo (36,37). Dati non pubblicati che confrontano la differenziazione degli adipociti sottocutanei tra uomini europei e dell'Asia meridionale corrispondenti all'età e al BMI hanno rilevato una dimensione dell'effetto PPARγ di 0,72 (calcolata utilizzando GPower). Supponendo che lo studio possa trovare una dimensione dell'effetto simile tra pazienti affetti da sepsi e controlli, i ricercatori richiedono che n = 25 partecipanti rilevino un livello simile di differenza nell'espressione genica con una potenza dell'80%. Di conseguenza, i ricercatori prevedono che n=30 pazienti per gruppo saranno sufficienti per mostrare differenze significative nella funzione degli adipociti per lo studio proposto, consentendo alcune analisi incomplete.

      Descrizione dei metodi statistici Il risultato primario sarà analizzato utilizzando un modello misto ANOVA a 2 vie. Variabili indipendenti saranno la presenza o assenza di sepsi e il deposito di tessuto adiposo campionato (sottocutaneo e viscerale). La variabile dipendente sarà la quantità di citochine secrete. I ricercatori includeranno nel modello covariate note per influenzare la distribuzione e la funzione del tessuto adiposo come età, sesso, BMI e, ove disponibile, rapporto SAT:VAT (come misurazione della distribuzione del tessuto adiposo).

      Per le analisi in cui non sono disponibili sia SAT che IVA, le popolazioni verranno confrontate utilizzando test t a due campioni in cui i dati sono distribuiti normalmente (o possono essere trasformati per ottenere ciò) o il test u di Mann Whitney se distribuiti non parametricamente.

      Livello di significatività da utilizzare Un valore p <0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi secondarie saranno puramente esplorative e dovrebbero essere interpretate come generatrici di ipotesi.

      Etica e governance clinica Approvazione etica Il presente protocollo e eventuali modifiche saranno presentati al Comitato etico della ricerca scozzese (REC), con l'autorità di rivedere gli studi che richiedono l'approvazione ai sensi della legge sugli adulti con incapacità (Scozia) del 2000. Una copia della decisione documentata del REC sarà a disposizione dello sponsor e degli uffici di ricerca e sviluppo (R&S) appropriati in ciascuno dei siti per l'approvazione formale dello studio. Solo i siti a cui è stata concessa l'approvazione etica attraverso la valutazione specifica del sito e l'approvazione della direzione della ricerca e sviluppo potranno avviare lo studio.

      Dichiarazione di conformità Questo studio aderirà ai principi della legge sulla protezione dei dati e del regolamento generale sulla protezione dei dati (GDPR), della Dichiarazione di Helsinki e di tutte le linee guida e la legislazione pertinenti che regolano la ricerca clinica. I ricercatori sono responsabili della conduzione dello studio in conformità con i principi delle linee guida della Conferenza internazionale sull'armonizzazione delle buone pratiche cliniche (ICH-GCP) (www.ich.org). Tutti i membri del gruppo di studio dovranno aver completato la formazione GCP.

      Consenso informato La vulnerabilità di questo gruppo di studio è pienamente apprezzata e sarà intrapreso ogni sforzo per proteggere la loro sicurezza e il loro benessere. In linea con i requisiti normativi applicabili e per rispettare il quadro di governance della ricerca, i processi di consenso saranno standardizzati e verrà rispettata una solida procedura operativa standard per i pazienti consenzienti. Il primo contatto sarà da parte del personale clinico che si prende cura del paziente.

      Riservatezza del paziente Per mantenere la riservatezza, tutti i moduli di segnalazione dei casi (CRF), i rapporti di studio e le comunicazioni relative allo studio identificheranno i pazienti solo tramite l'identificatore univoco dello studio assegnato e le iniziali. La riservatezza del paziente sarà mantenuta in ogni fase e i dati non saranno resi pubblici nella misura consentita dalle leggi e dai regolamenti applicabili.

      Sponsorizzazione Questo studio sarà sponsorizzato da NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.