Adipozita a imunometabolismus u sepse (AIMS)

Hypotéza Hypotézou je, že tuková tkáň pacientů, kteří jsou kriticky nemocní sepsí, bude vykazovat změny ve struktuře, zvýšenou zánětlivou funkci a zvýšenou mitochondriální dysfunkci ve srovnání s kontrolními pacienty bez sepse. Vyšetřovatelé také předpokládají, že zvýšená zánětlivá funkce bude výraznější u DPH než u SAT.

Cíle Cílem výzkumníků je prozkoumat potenciální rozdíly ve struktuře tukové tkáně, zánětlivé funkci a mitochondriální dysfunkci mezi jedinci se sepsí a bez ní a mezi SAT a VAT.

Studovat design

Budou dvě kohorty pacientů:

1. Pacienti podstupující urgentní chirurgický zákrok s diagnózou sepse

   A. 15-30 pacientů

2. Pacienti přijati na jednotku intenzivní péče s diagnózou sepse

   1. 15-30 pacientů

      Výsledky od pacientů se sepsí budou porovnány s výsledky získanými od kohorty pacientů zařazených do předchozí studie (studie CONNECT: IRAS projekt ID 291251; REC reference 21/NS/0015). Tito pacienti jsou přijímáni, když podstupují elektivní operaci břicha, bez známek akutního zánětlivého procesu. Když byli přijati do studie, podstoupí identický proces odběru vzorků tuku a krve, jaký je popsán v této studii.

      Nastavení studie Pacienti se budou rekrutovat z operačních sálů a jednotek kritické péče v Univerzitní nemocnici královny Alžběty v Glasgow.

      Vzorky tukové tkáně budou odebrány pouze těm, kteří potřebují sedaci nebo celkovou anestezii pro tracheální intubaci, a to buď na jednotce intenzivní péče, nebo na operačním sále.

      Souhlas Proces souhlasu Pacienti na JIP, zejména v akutní fázi svého onemocnění, často postrádají schopnost rozhodovat kvůli deliriu a účinkům sedativních léků. Aby bylo možné vyhodnotit změny, ke kterým dochází v tukové tkáni během akutní fáze kritického onemocnění, je důležité provést odběr vzorků co nejdříve po přijetí pacienta na JIP. Očekává se, že pacienti přijatí na JIP v této studii nebudou moci prospektivně souhlasit se zařazením do této studie. Výzkumný pracovník si proto vyžádá souhlas právního zástupce sociálního zabezpečení, opatrovníka sociálního zabezpečení nebo nejbližšího příbuzného. Tento výzkumný pracovník bude vyškolen v postupech souhlasu, které dodržují etické zásady uvedené v Helsinské deklaraci a ve Skotském zákoně o dospělých s nezpůsobilostí (2000). Výzkumník poskytne informační list studie a formulář souhlasu a zkontroluje obsah, aby se ujistil, že porozuměl postupům, přínosům a rizikům studie. Oslovená osoba bude požádána, aby dala souhlas na základě jejího vnímání přání pacienta, pokud má kapacitu. Poté budou vyzváni k podpisu formuláře souhlasu. Originál bude uchován ve složce vyšetřujícího pracoviště a kopie bude předána osobě, která formulář podepsala, a další kopie bude vložena do lékařských záznamů pacientů.

      Souhlas pacienta s pokračováním Pacienti, kteří se studií souhlasili právníkem sociálního zabezpečení, sociálním opatrovníkem nebo nejbližším příbuzným, budou osloveni s žádostí o povolení pokračovat ve studii, jakmile po kritickém onemocnění obnoví kapacitu. Na pacienty se obrátí patřičně vyškolený člen výzkumného týmu a poskytne jim informační list studie a kopii formuláře Souhlas s pokračováním. Výzkumník s pacientem zkontroluje jejich obsah, poskytne mu vysvětlení a příležitost k otázkám. Pacienti, kteří v této fázi odmítnou účast, budou ze studie vyřazeni.

      Odstoupení ze studie Účastníci mohou ze studie kdykoli odstoupit, aniž by utrpěli jakoukoli nevýhodu.

      Studijní postupy Sběr klinických dat

      Základní údaje budou shromážděny pro všechny pacienty zařazené do studie. To bude zahrnovat, ale není omezeno na:

      • Stáří
      • Sex
      • BMI
      • Hlavní komorbidity

      U pacientů přijatých na JIP budou shromažďovány další údaje s ohledem na jejich akutní onemocnění. To bude zahrnovat, ale není omezeno na:

      • APACHE II

      • Biochemické a hematologické parametry, pokud jsou měřeny klinicky:

        • Nejvyšší C-reaktivní protein během prvních 48 hodin
        • Nejvyšší počet bílých krvinek během prvních 48 hodin
        • Nejvyšší prokalcitonin během prvních 48 hodin
        • Nejvyšší laktát během prvních 48 hodin

      • Fyziologické parametry:

        • Nejvyšší tepová frekvence za prvních 48 hodin (v tepech za minutu)
        • Nejvyšší dávka noradrenalinu během prvních 48 hodin (v mcg/min)
        • Nejnižší poměr P:F během prvních 48 hodin
        • Nejvyšší dávka inzulínu podaná během prvních 48 hodin (v jednotkách/h)

      • Údaje o výsledku:

        • Délka pobytu na JIP
        • Výsledek JIP
        • Počet dní vyžadujících invazivní mechanickou ventilaci
        • Počet dní vyžadujících kardiovaskulární podporu
        • Počet dní vyžadujících renální substituční terapii
        • Délka pobytu v nemocnici
        • Výsledek nemocnice

      Sběr obrazových dat

      Vyšetřovatelé zhodnotí klinické zobrazení získané pro každého pacienta zařazeného do studie. Pro analýzu složení těla odvozenou z CT bude vhodný každý pacient, který během 12 měsíců před přijetím na JIP nebo 48 hodin po přijetí podstoupil CT vyšetření, které zahrnuje úroveň obratle L3. Získá se jediný obrazový řez na úrovni obratle L3. Tento obrázek bude poté identifikován a stažen z PACS do počítače NHS Greater Glasgow a Clyde. Deidentifikovaný obrázek bude poté nahrán do softwarového programu CoreSlicer a analyzován, jak bylo popsáno dříve (35). To umožní výpočet plochy viscerální tukové tkáně, podkožní tukové tkáně a svalové hmoty. To může poskytnout podrobnější posouzení adipozity jednotlivce než samotný BMI.

      Odběr krve a tukové tkáně Odběr krve Až 40 ml krve bude odebráno vyškoleným personálem při náboru do studie.

      Odběr tukové tkáně u pacientů na jednotce intenzivní péče Tuková tkáň bude odebrána 5 cm laterálně od pupku za sterilních podmínek pomocí 20ml stříkačky Terumo™ Luer Tip připojené k 14G 80mm Sterican hluboké intramuskulární jehle na jedno použití předem naplněné přibližně 5 ml 0,9% solný. Každý průchod biopsií shromáždí v průměru 0,3 g tkáně, takže tři průchody by měly poskytnout až 1 g tukové tkáně. To bude filtrováno přes 100μm nylonový síťový filtr a přepraveno do laboratoře v 15 ml předehřátého (370C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts roztoku.

      Odběr tukové tkáně u pacientů podstupujících neodkladnou operaci Jak podkožní, tak viscerální tuková tkáň bude odebrána pod přímým dohledem chirurgického týmu. Z každého místa bude odebrán přibližně 1 g tkáně. To bude dopraveno do laboratoře v 15 ml předehřátého (370 C) Gibco™ Medium 199, Hanks' Balanced Salts roztoku.

      Přeprava vzorků na University of Glasgow Všechny vzorky (krev a tuková tkáň) budou zabaleny pro přepravu na University of Glasgow v souladu s aktuálními směrnicemi Health Protection Scotland.

      Předpokládaná délka účasti subjektu Celý postup, včetně odběru krve a odběru tukové tkáně, by měl trvat méně než 30 minut.

      Analýza tukové tkáně Z 1g biopsie tukové tkáně lze připravit 300 ul 90% cytokritových adipocytů a stromovaskulární frakci (SVF). Pokud je k dispozici další tuková tkáň, bude rychle zmrazena v tekutém dusíku a uložena při -80 °C pro pozdější histologickou analýzu.

      Určení velikosti adipocytů bude provedeno na nefixovaných čerstvých suspenzích adipocytů (5 µl) izolovaných kolagenázovým štěpením biopsie, zobrazených na mikroskopu Olympus BX50 s použitím čočky x10 připojené k barevné kameře 3-CCD (JVC) pro digitální snímání obrazu s automatickým Image J dimenzování.

      Bazální a lipopolysacharidem (1 uM) stimulovaná sekrece adipokinu, korigovaná na počet buněk pomocí koncentrací DNA v suspenzi adipocytů (izolovaných současně s RNA), bude hodnocena v izolovaných adipocytech (v duplikátu 50 ul na test) po 2 hodinách při 37 °C, jak bylo popsáno dříve (36).

      Exprese zánětlivého genu adipocytů bude kvantifikována relativně k endogennímu kontrolnímu PPIA v RNA izolované ze suspenze adipocytů (95 ul, výtěžek přibližně 500 ng RNA) pomocí TRIzol (ThermoFisher Scientific). Vybrané cíle budou předem amplifikovány v RNA s následnou kvantifikací Taqman RT-PCR pomocí komerčních sad primerových sond (ThermoFisher Scientific).

      Buňky SVF budou kultivovány v baňkách o objemu 25 cm2, v inkubátoru při 37 °C 5% CO2, v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) a odebírány vzorky po 2 a 24 hodinách pro analýzu cytokinů. Kultivace (pasáž 0) bude pokračovat, aby se umožnila adheze preadipocytů, přičemž médium se vyměňuje každé 3-4 dny až do 80% konfluence, kdy bude preadipocyt pasážován až do 80% konfluentnosti (pasáž 1). Na konci pasáže 1 se preadipocyty oddělí a zmrazí na 500 000 buněk/ml v DMEM, 20 % FBS, 10 % dimethylsulfoxidu [DMSO, DLM-10RG-PK], 100 U/ml penicilin-streptomycinu a 2 mM L-Glutamin) a skladovány v kapalném dusíku pro pozdější analýzu pre-adipocytové diferenciace.

      Kvantifikace cytokinů bude prováděna pomocí vícenásobných čipů s magnetickými kuličkami (Merck Millipore) na systému MAGPIX® xPONENT 4.2 nebo komerční ELISA.

      Vaskularizace tukové tkáně a fibróza budou hodnoceny na dostupných zmrazených biopsiích vložených do OCT. Kryořezy (10 µm) budou imunobarveny pomocí anti-CD31 k identifikaci krevních cév. Hustota krevních cév bude vypočítána jako poměr počtu krevních cév k celkové ploše řezu. Fibróza tukové tkáně bude hodnocena pomocí analýzy picosirius red a Image J.

      Adipocyty budou obarveny pomocí MitoTracker Green FM a MitoTracker Red podle pokynů výrobce a zobrazeny pomocí fluorescenční mikroskopie v BHF GCRC Imaging Suite. Snímky budou analyzovány za účelem posouzení morfologie mitochondrií (propojenost, velikost a bobtnání) pomocí softwaru Mitomorph. Obsah adipocytových mitochondrií bude také hodnocen po barvení JC-1 jako intenzita fluorescence na buňku v Cellometru. Obsah mitochondrií bude potvrzen pomocí nezávislé metody poměru mtDNA/jaderná DNA pomocí exprese MT-CO2, MT-CYB, PPARG a UCP1 pomocí Taqman RT-PCR.

      Mitochondriální štěpení/fúze bude odhadnuta kvantifikací exprese genů/proteinů zapojených do mitochondriálního štěpení (DNM1L) a fúze (MFN1, MFN2 a RHOT1) pomocí Taqman RT-PCR a western blottingu.

      Genová a proteinová exprese mitochondriálního respiračního komplexu a proteinů oxidace mastných kyselin bude provedena pomocí Taqman RT-PCR a western blotting.

      Analýza krevního vzorku Plazma se oddělí a zmrazí v alikvotech při -80 stupních Celsia. Plazmatický adipokin (např. hladiny adiponektinu, visfatinu) budou měřeny pomocí komerčního testu ELISA podle standardních protokolů produktu.

      Klinický management pacientů ve studii V rámci této studie nedojde k žádným změnám v klinickém managementu pacientů.

      Posouzení bezpečnosti Definice nežádoucích příhod Nežádoucí příhody (AE) a vážné nežádoucí příhody (SAE) jsou definovány podle glosáře pojmů Mezinárodní konference o harmonizaci správné klinické praxe (ICH-GCP).

      Nežádoucí účinky Vpichy jehlou pro odběr krve a tukové tkáně nezpůsobují u většiny pacientů žádné vážné problémy. Existuje malé riziko, že propíchnutí jehlou může způsobit závratě, nepohodlí, krvácení, modřiny nebo infekce v místě.

      Zaznamenávání a hlášení nežádoucích příhod Jakákoli nepříznivá zdravotní událost u pacienta zapojeného do studie související s odběrem vzorků bude zaznamenána a hlášena v souladu s Rámcem řízení výzkumu (tj. ročně pro AE a do 15 dnů pro SAE). Jakákoli SAE, která je neočekávaná a souvisí s odběrem vzorků, bude nahlášena Etické komisi pro výzkum do 15 dnů poté, co se hlavní zkoušející o události dozvěděl. Souhrn AE a SAE bude každoročně poskytován Etickému výboru pro výzkum a Kanceláři pro výzkum a vývoj, NHS GGC. AE a SAE budou shromažďovány ve formulářích pro kazuistiku během období studie.

      Sběr a správa dat Přímý přístup ke zdrojovým datům/dokumentům Informace o konkrétních pacientech budou dostupné z elektronického systému správy pacientských dat (IntelliSpace Critical Care and Anesthesia, Phillips Medical Systems) az elektronického záznamu pacienta z klinického portálu. Přístup k těmto datovým systémům pro účely studie bude omezen na vhodně pověřené členy studijního týmu. Přístup interních nebo externích auditorů bude řízen v souladu s příslušnými standardními operačními postupy Glasgow Clinical Research Facility.

      Datové centrum Všechna identifikovatelná data shromážděná v rámci NHS Greater Glasgow a Clyde (NHS GGC) zůstanou v NHS GGC. S University of Glasgow budou sdílena pouze anonymizovaná data a vzorky tkání.

      Všechny vzorky tkáně budou zpracovány a analyzovány na University of Glasgow School of Cardiovascular and Metabolic Health (SCMH) a přebytečné vzorky budou uloženy do biobanky. Vzorky biobanky a související data budou uchovávány a používány v souladu se zásadami SCMH.

      Žádosti o přístup k datům generovaným v této studii by měly být zaslány hlavnímu zkoušejícímu a budou posuzovány individuálně případ od případu a budou projednány se sponzorem.

      Uchovávání údajů Údaje budou uchovávány po dobu 5 let po dokončení studie a zůstanou v odpovědnosti hlavního zkoušejícího.

      Zajištění kvality Během a/nebo po dokončení studie mohou pracovníci pověření zajišťováním kvality jmenovaní NHS GGC nebo regulačními orgány chtít provést audity na místě. Od hlavního zkoušejícího se očekává, že bude spolupracovat při jakémkoli auditu a poskytne pomoc a dokumentaci (včetně zdrojových dat), jak bude požadováno.

      Statistika Velikost vzorku Celkem bude přijato 60 pacientů, přičemž 30 pacientů podstoupí urgentní chirurgický zákrok a 30 pacientů, kteří byli přijati na jednotku intenzivní péče. (jak je podrobně uvedeno v části Návrh studie výše).

      Zánětlivá funkce tukové tkáně nebyla v lidské tkáni u pacientů se sepsí v intenzivní péči zkoumána. Předchozí práce zjistila signifikantní rozdíly v inzulinové rezistenci adipocytů, sekreci adipokinu a expresi genů mezi pacientkami s preeklampsií a zdravým těhotenstvím s n=13 pacientkami na skupinu (36,37). Nepublikovaná data porovnávající diferenciaci subkutánních adipocytů mezi věkem a BMI evropských a jihoasijských mužů nalezla velikost účinku PPARγ 0,72 (vypočteno pomocí GPower). Za předpokladu, že studie může najít podobnou velikost účinku mezi pacienty se sepsí a kontrolami, výzkumníci požadují, aby n=25 účastníků detekovalo podobnou úroveň rozdílu v genové expresi s 80% silou. V souladu s tím vědci předpokládají, že n=30 pacientů na skupinu bude postačovat k prokázání významných rozdílů ve funkci adipocytů pro navrhovanou studii, což umožňuje některé neúplné analýzy.

      Popis statistických metod Primární výsledek bude analyzován pomocí 2-cestného smíšeného modelu ANOVA. Nezávislými proměnnými budou přítomnost nebo nepřítomnost sepse a odběr vzorků tukové tkáně (subkutánní a viscerální). Závislou proměnnou bude množství vylučovaného cytokinu. Vyšetřovatelé zahrnou do modelu kovariáty, o kterých je známo, že ovlivňují distribuci a funkci tukové tkáně, jako je věk, pohlaví, BMI a tam, kde je to možné, poměr SAT:VAT (jako měření distribuce tukové tkáně).

      Pro analýzy, ve kterých nejsou k dispozici jak SAT, tak DPH, budou populace porovnávány pomocí dvouvýběrových t-testů, kde jsou data normálně distribuována (nebo mohou být transformována, aby toho bylo dosaženo), nebo Mann Whitney u-testem, pokud jsou neparametricky rozděleny.

      Použitá hladina významnosti Hodnota p <0,05 bude považována za statisticky významnou. Všechny sekundární analýzy budou čistě průzkumné a měly by být interpretovány jako hypotézy.

      Etické a klinické řízení Etické schválení Tento protokol a všechny jeho dodatky budou předloženy Etickému výboru pro výzkum ve Skotsku A (REC), s pravomocí přezkoumávat studie vyžadující schválení podle zákona o dospělých s nezpůsobilostí (Skotsko) z roku 2000. Kopie zdokumentovaného rozhodnutí EK bude k dispozici zadavateli a příslušným kancelářím pro výzkum a vývoj (R&D) v každém z míst za účelem formálního schválení studie. Studii budou moci zahájit pouze místa, kterým byl udělen etický souhlas prostřednictvím posouzení specifického pro dané místo a schválení vedení výzkumu a vývoje.

      Prohlášení o shodě Tato studie bude dodržovat zásady zákona o ochraně osobních údajů a obecných nařízení o ochraně údajů (GDPR), Helsinské deklarace a všech příslušných pokynů a právních předpisů upravujících klinický výzkum. Vyšetřovatelé jsou odpovědní za provedení studie v souladu se zásadami pokynů Mezinárodní konference o harmonizaci správné klinické praxe (ICH-GCP) (www.ich.org). Všichni členové studijního týmu budou muset absolvovat školení GCP.

      Informovaný souhlas Zranitelnost této studijní skupiny je plně oceňována a bude vynaloženo veškeré úsilí na ochranu její bezpečnosti a pohody. V souladu s platnými regulačními požadavky a v souladu s Rámcem řízení výzkumu budou procesy udělování souhlasu standardizovány a bude dodržován robustní standardní operační postup pro souhlasné pacienty. První kontakt bude s klinickým personálem pečujícím o pacienta.

      Důvěrnost pacienta Aby byla zachována důvěrnost, všechny formuláře kazuistik (CRF), zprávy o studii a komunikace týkající se studie identifikují pacienty pouze podle přiděleného jedinečného identifikátoru studie a iniciál. Důvěrnost pacienta bude zachována v každé fázi a data nebudou veřejně dostupná v rozsahu povoleném platnými zákony a předpisy.

      Sponzorství Tato studie bude sponzorována společností NHS Greater Glasgow & Clyde Research & Innovation.