人工関節感染症の診断のための新しい分子アプローチ

対象者 再建外科・骨関節感染症科（CRIO）とサンタンブロージョ市ガレアッツィ病院 IRCCS の股関節部門から、プロテーゼの感染が疑われる患者計 70 名が研究に登録される。 各サンプルは、伝統的な培養と次世代シーケンス (NGS) の両方を使用して分析されます。

培養結果に基づいて、患者は 3 つのグループに分けられます。

分子分析のためのサンプル収集 巨視的に感染の兆候がある人工器官周囲組織から、滑膜、骨と人工器官の界面、および髄内管からサンプルを採取します。 関節切開術を行う前に、NGS 分析のために滑液を DNAse および RNAse を含まない容器に無菌的に収集します。 滅菌綿棒およびパッドは、NGS 分析のために組織と骨インプラントの間の界面および髄内管からサンプルを収集するために使用されます。 骨組織は新しい滅菌器具を使用して収集されます。 サンプルは収集から 2 時間以内に -80°C で凍結されます。

培養のためのサンプル収集 人工器官周囲組織およびインプラントのサンプル収集は、手術中に患部を適切に露出させた後に行われます。 滑液は滅菌スクリューキャップチューブに収集されます。 人工器官周囲の組織とインプラントは、新しい滅菌器具を使用して滅菌容器に収集されます。 すべてのサンプルは収集から 2 時間以内に研究所に送られます。 バイオフィルムから細菌を除去するために0.1% (w:v) ジチオスレイトールで処理した後のサンプルは、寒天プレートおよび好気性菌および嫌気性菌用の培養液上で15日間培養されます。 微生物の同定は生化学的アッセイによって行われます。

別の滅菌スクリューキャップチューブに収集されたさらなる組織サンプルは、ショットガン NGS の微生物 DNA を単離するための宿主 DNA の除去に使用されます。 サンプルはサポニンおよび/または微生物 DNA 抽出用のさまざまな市販キットで処理されます。 dsDNA は Qubit 蛍光光度計で定量され、その純度はナノドロップ分光光度計で測定されます。

滑液分析 白血球数および分別のための滑液は、エチレンジアミノ四酢酸 (EDTA) を含むチューブに収集され、Sysmex XN 血液分析装置によって分析されます。

滑膜タンパク質、グルコース、C 反応性タンパク質 (CRP)、および白血球エステラーゼの測定は、凝固活性化因子を含むチューブに収集された滑液で実行されます。 タンパク質、グルコースおよびCRPの測定はAtellica CHおよびIMアナライザー(Siemens)で行われ、白血球エステラーゼは尿検査用のストリップを使用して測定されました。

分子分析 70 個のサンプルは専門の研究室に送られ、細胞物質の濃縮、機械的溶解、有機阻害剤とヒト宿主 DNA の除去など、カスタマイズされた独自の技術を使用して生物学的標本タイプから核酸抽出が行われます。 品質を保証するために、すべての標本はポジティブおよびネガティブ抽出コントロールで処理されます。

研究の終了時に、残存する生物学的物質はすべて破壊されます。

統計的方法論 サンプルサイズ サンプルサイズは、患者を人工関節感染症の陽性または陰性として定義する際の、革新的な分子法と人工関節周囲組織および滑液の伝統的な培養の一致を主要結果として考慮して計算されました。 研究者の経験に基づくと、IRCCS ガレアッツィ・サンタンブロージョ病院で膝と股関節のインプラント不全に対する再手術を受け、文化検査に基づいて人工関節感染症と診断された患者の割合は 45% です。 誤差範囲 15%、アルファ = 0.05、検出力 = 80% を考慮すると、検査対象の患者数は 70 人になります。

分析方法 カテゴリ データは絶対頻度と相対頻度として記述され、連続データは正規分布の場合は平均値と 95% 信頼区間、非正規分布の場合は中央値と四分位範囲として記述されます。 正規分布は、Shapiro-Wilk 検定によって評価されます。

比率の差は、フィッシャーの直接確率検定またはカイ二乗検定によって評価されます。 3 つのグループ間の連続変数の比較は、正規分布データの場合は一元配置分散分析 (ANOVA) 検定を使用するか、非正規分布の場合はクラスカル-ワリス検定を使用して実行されます。

分子的手法とプロテス周囲組織および滑液の従来の培養との一致は、Choen のカッパを使用してテストされます。

各アッセイの感度と特異性も評価されます。