Novas abordagens moleculares para diagnóstico de infecção protética articular

Sujeitos Um total de 70 pacientes do Departamento de Cirurgia Reconstrutiva e Infecções Osteoarticulares (CRIO) e das Unidades de Quadril do IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogio por suspeita de infecção de suas próteses serão inscritos no estudo. Cada amostra será analisada com cultura tradicional e sequenciamento de próxima geração (NGS).

Com base nos resultados da cultura, os pacientes serão divididos em 3 grupos.

Coleta de amostras para análise molecular Amostras de tecido periprotético com sinais macroscópicos de infecção serão retiradas da membrana sinovial, interface osso-protética e canais intramedulares. O líquido sinovial será coletado estéril em recipientes livres de DNAse e RNAse para análise NGS antes de realizar a artrotomia. Swabs e absorventes estéreis serão usados ​​para coletar amostras da interface entre o tecido e o implante ósseo e do canal intramedular para análise NGS. O tecido ósseo será coletado com nova instrumentação estéril. As amostras serão congeladas dentro de 2 horas a partir da coleta a -80°C até.

Coleta de amostras para cultura A coleta de amostras de tecidos periprotéticos e implante será realizada durante a cirurgia após a devida exposição do local afetado. O líquido sinovial será coletado em tubos estéreis com tampa de rosca. Os tecidos periprotéticos e o implante serão coletados em recipientes estéreis usando nova instrumentação estéril. Todas as amostras serão enviadas ao Laboratório em até 2 horas após a coleta. Amostras após tratamento com Ditiotreitol 0,1% (p:v) para desalojar bactérias do biofilme serão cultivadas em placas de ágar e caldo para aeróbios e anaeróbios por 15 dias. A identificação microbiana será realizada por ensaios bioquímicos.

Uma outra amostra de tecido, coletada em um tubo estéril separado com tampa de rosca, será usada para remoção de DNA do hospedeiro para isolar DNA microbiano, para NGS shotgun. As amostras serão tratadas com saponina e/ou diferentes kits comerciais para extração de DNA microbiano. O dsDNA será quantificado com fluorômetro Qubit e sua pureza será determinada com espectrofotômetro nanodrop.

Análise do líquido sinovial O líquido sinovial para contagem e diferencial de leucócitos será coletado em tubos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e analisado por meio de um analisador hematológico Sysmex XN.

A determinação de proteína sinovial, glicose, proteína C reativa (PCR) e esterase leucocitária será realizada em líquido sinovial coletado em tubos contendo ativador de coágulo. A dosagem de proteínas, glicose e PCR será realizada em analisador Atellica CH e IM (Siemens) enquanto a esterase leucocitária foi determinada pelo uso de tiras para urinálise.

Análise molecular 70 amostras serão enviadas para um laboratório especializado que realizará a extração de ácido nucleico de tipos de amostras biológicas usando técnicas proprietárias personalizadas que incluem concentração de material celular, lise mecânica e remoção de inibidores orgânicos e DNA do hospedeiro humano. Cada amostra será processada com um controle de extração positivo e negativo para garantir a qualidade.

No final do estudo qualquer material biológico residual será destruído

Metodologia estatística Tamanho da amostra O tamanho da amostra foi calculado considerando como resultado primário a concordância do método molecular inovador e da cultura tradicional de tecido periprostético e líquido sinovial na definição de um paciente como positivo ou negativo para infecções articulares protéticas. Com base na experiência dos investigadores, a proporção de pacientes submetidos à cirurgia de revisão para falha de implante de joelho e quadril no IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio com diagnóstico de infecção protética articular com base no exame cultural é de 45%. Considerando uma margem de erro de 15%, alfa = 0,05 e poder = 80%, o número de pacientes a serem testados é 70.

Metodologia de análise Os dados categóricos serão descritos como frequências absolutas e relativas, enquanto os dados contínuos serão descritos como média e intervalo de confiança de 95%, se distribuídos normalmente, ou como mediana e intervalo interquartil, no caso de distribuição não normal. A distribuição normal será avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk.

As diferenças de proporção serão avaliadas pelo teste exato de Fisher ou teste Qui-quadrado; a comparação de variáveis ​​​​contínuas entre os três grupos será realizada por meio do teste de análise de variância unidirecional (ANOVA) para dados normalmente distribuídos ou com o teste de Kruskal-Wallis, no caso de distribuição não normal.

A concordância entre os métodos moleculares com a cultura tradicional de tecido periprostético e líquido sinovial será testada usando o kappa de Choen.

A sensibilidade e especificidade de cada ensaio também serão avaliadas.