Nuovi approcci molecolari per la diagnosi dell'infezione articolare protesica

Soggetti Verranno arruolati nello studio un totale di 70 pazienti provenienti dal Dipartimento di Chirurgia Ricostruttiva e Infezioni Osteoarticolari (CRIO) e dalle Unità Anca dell'IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogio per sospetta infezione della loro protesi. Ogni campione verrà analizzato sia con colture tradizionali che con Next Generation Sequencing (NGS).

Sulla base dei risultati colturali i pazienti verranno divisi in 3 gruppi.

Raccolta dei campioni per l'analisi molecolare I campioni di tessuto periprotesico con segni macroscopici di infezione verranno prelevati dalla membrana sinoviale, dall'interfaccia osso-protesi e dai canali intramidollari. Il liquido sinoviale verrà raccolto sterilmente in contenitori privi di DNAsi e RNAsi per l'analisi NGS prima di eseguire l'artrotomia. Verranno utilizzati tamponi e tamponi sterili per raccogliere campioni dall'interfaccia tra tessuto e impianto osseo e dal canale intramidollare per l'analisi NGS. Il tessuto osseo verrà raccolto con nuova strumentazione sterile. I campioni verranno congelati entro 2 ore dalla raccolta a -80°C fino al .

Raccolta dei campioni per la coltura La raccolta dei campioni dei tessuti periprotesici e dell'impianto verrà eseguita durante l'intervento dopo la corretta esposizione del sito interessato. Il liquido sinoviale verrà raccolto in provette sterili con tappo a vite. I tessuti periprotesici e gli impianti verranno raccolti in contenitori sterili utilizzando nuova strumentazione sterile. Tutti i campioni verranno inviati al Laboratorio entro 2 ore dal prelievo. I campioni dopo il trattamento con ditiotreitolo allo 0,1% (p:v) per rimuovere i batteri dal biofilm verranno coltivati ​​su piastre di agar e brodo per aerobi e anaerobi per 15 giorni. L'identificazione microbica sarà effettuata mediante saggi biochimici.

Un ulteriore campione di tessuto, raccolto in una provetta sterile separata con tappo a vite, verrà utilizzato per la rimozione del DNA ospite per isolare il DNA microbico, per NGS di fucile. I campioni verranno trattati con saponina e/o diversi kit commerciali per l'estrazione del DNA microbico. Il dsDNA sarà quantificato con un fluorimetro Qubit e la sua purezza sarà determinata con uno spettrofotometro a nanogocce.

Analisi del liquido sinoviale Il liquido sinoviale per la conta leucocitaria e differenziale sarà raccolto in provette contenenti acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) e analizzato mediante un analizzatore ematologico Sysmex XN.

La determinazione della proteina sinoviale, del glucosio, della proteina C-reattiva (CRP) e dell'esterasi leucocitaria verrà eseguita sul liquido sinoviale raccolto in provette contenenti attivatore della coagulazione. La misurazione delle proteine, del glucosio e della PCR sarà effettuata sull'analizzatore Atellica CH e IM (Siemens) mentre l'esterasi leucocitaria sarà determinata utilizzando strisce per l'analisi delle urine.

Analisi molecolare 70 campioni verranno inviati a un laboratorio specializzato che eseguirà l'estrazione dell'acido nucleico da tipi di campioni biologici utilizzando tecniche proprietarie su misura che includono la concentrazione di materiale cellulare, lisi meccanica e rimozione di inibitori organici e DNA ospite umano. Ogni campione verrà elaborato con un controllo di estrazione positivo e negativo per garantirne la qualità.

Al termine dello studio l'eventuale materiale biologico residuo verrà distrutto

Metodologia statistica Dimensione del campione La dimensione del campione è stata calcolata considerando come risultato primario la concordanza tra l'innovativo metodo molecolare e la tradizionale coltura del tessuto periprostetico e del liquido sinoviale nel definire un paziente come positivo o negativo per le infezioni delle protesi articolari. Sulla base dell'esperienza degli sperimentatori, la percentuale di pazienti sottoposti a intervento di revisione per fallimento di impianto di ginocchio e anca presso l'IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio con diagnosi di infezione dell'articolazione protesica basata sull'esame colturale è del 45%. Considerando un margine di errore del 15%, un alfa = 0,05 e una potenza = 80%, il numero di pazienti da testare è 70.

Metodologia di analisi I dati categorici saranno descritti come frequenze assolute e relative, mentre i dati continui saranno descritti come media e intervallo di confidenza al 95%, se distribuiti normalmente, o come mediana e intervallo interquartile, in caso di distribuzione non normale. La distribuzione normale sarà valutata mediante il test di Shapiro-Wilk.

Le differenze proporzionali verranno valutate mediante il test esatto di Fisher o test del Chi quadrato; il confronto delle variabili continue tra i tre gruppi sarà effettuato utilizzando il test ANOVA (One-Way Analysis Of Variance) per dati distribuiti normalmente o con il test Kruskal-Wallis, in caso di distribuzione non normale.

L'accordo tra metodi molecolari e colture tradizionali di tessuto periprostetico e liquido sinoviale sarà testato utilizzando la kappa di Choen.

Verranno inoltre valutate la sensibilità e la specificità di ciascun saggio.