Uusia molekulaarisia lähestymistapoja proteettisten nivelinfektioiden diagnosointiin

Koehenkilöt Tutkimukseen otetaan yhteensä 70 potilasta rekonstruktiivisen kirurgian ja niveltulehdusten osastolta (CRIO) ja IRCCS Ospedale Galeazzi -Sant'Ambrogion lonkkayksiköistä, joiden epäillään olevan proteesin infektio. Jokainen näyte analysoidaan sekä perinteisellä kulttuurilla että seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmällä (NGS).

Viljelytulosten perusteella potilaat jaetaan 3 ryhmään.

Näytteenotto molekyylianalyysiä varten Näytteet peri-proteesikudoksesta, jossa on makroskooppisia infektion merkkejä, otetaan nivelkalvolta, luun ja proteesin rajapinnalta ja intramedullaarisista kanavista. Nivelneste kerätään steriilisti DNAaasi- ja RNAase-vapaisiin astioihin NGS-analyysiä varten ennen artrotomian suorittamista. Steriilejä vanupuikkoja ja tyynyjä käytetään näytteiden keräämiseen kudoksen ja luu-implanttien välisestä rajapinnasta ja intramedullaarisesta kanavasta NGS-analyysiä varten. Luukudos kerätään uusilla steriileillä instrumenteilla. Näytteet pakastetaan 2 tunnin sisällä keräämisestä -80°C:ssa asti.

Näytteenotto viljelyä varten Näytteenotto periprosteettisista kudoksista ja implantista suoritetaan leikkauksen aikana sen jälkeen, kun sairaskohta on altistettu asianmukaisesti. Nivelneste kerätään steriileihin kierrekorkisiin putkiin. Periprosteettiset kudokset ja implantti kerätään steriileihin säiliöihin käyttämällä uutta steriiliä instrumentointia. Kaikki näytteet lähetetään laboratorioon 2 tunnin kuluessa keräämisestä. Näytteitä, jotka on käsitelty 0,1-prosenttisella (w:v) ditiotreitolilla bakteerien poistamiseksi biofilmistä, viljellään agarmaljoilla ja liemellä aerobeille ja anaerobeille 15 päivän ajan. Mikrobien tunnistaminen suoritetaan biokemiallisilla määrityksillä.

Lisäkudosnäyte, joka on kerätty erilliseen steriiliin kierrekorkiseen putkeen, käytetään isäntä-DNA:n poistamiseen mikrobi-DNA:n eristämiseksi haulikko-NGS:ää varten. Näytteet käsitellään saponiinilla ja/tai erilaisilla kaupallisilla välineillä mikrobien DNA:n uuttamista varten. DsDNA kvantifioidaan Qubit-fluorometrillä ja sen puhtaus määritetään nanodrop-spektofotometrillä.

Nivelnesteen analyysi Nivelneste leukosyyttien lukumäärän ja erotuksen suhteen kerätään etyleenidiaminotetraetikkahappoa (EDTA) sisältäviin putkiin ja analysoidaan Sysmex XN -hematologisella analysaattorilla.

Nivelkalvon proteiinin, glukoosin, C-reaktiivisen proteiinin (CRP) ja leukosyyttiesteraasin määritykset suoritetaan hyytymisaktivaattoria sisältäviin putkiin kerätyllä nivelnesteellä. Proteiinien, glukoosin ja CRP:n mittaus suoritetaan Atellica CH- ja IM-analysaattorilla (Siemens) ja leukosyyttiesteraasi määritettiin käyttämällä liuskoja virtsaan.

Molekyylianalyysi 70 näytettä lähetetään erikoislaboratorioon, joka suorittaa nukleiinihappojen uuttamisen biologisista näytetyypeistä käyttämällä räätälöityjä tekniikoita, joihin kuuluvat solumateriaalin väkevöinti, mekaaninen lyysi sekä orgaanisten estäjien ja ihmisen isäntä-DNA:n poistaminen. Jokainen näyte käsitellään positiivisella ja negatiivisella uuttokontrollilla laadun varmistamiseksi.

Tutkimuksen lopussa kaikki jäljelle jäänyt biologinen materiaali tuhotaan

Tilastollinen metodologia Näytteen koko Otoskoko on laskettu ottaen huomioon ensisijaisena tuloksena innovatiivisen molekyylimenetelmän ja periprosteettisen kudoksen ja nivelnesteen perinteisen viljelyn yhteisymmärrys määriteltäessä potilas positiiviseksi tai negatiiviseksi proteettisten niveltulehdusten suhteen. Tutkijoiden kokemuksen perusteella IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogiossa polvi- ja lonkkaimplanttien vajaatoiminnan korjaavien potilaiden osuus proteettisen niveltulehduksen diagnoosista kulttuuritutkimuksen perusteella on 45 %. Kun otetaan huomioon 15 % virhemarginaali, alfa = 0,05 ja teho = 80 %, testattavien potilaiden määrä on 70.

Analyysimenetelmä Kategoriset tiedot kuvataan absoluuttisina ja suhteellisina frekvenssinä, kun taas jatkuvat tiedot kuvataan keskiarvona ja 95 %:n luottamusvälinä, jos ne jakautuvat normaalisti, tai mediaani- ja kvartiilivälinä, jos kyseessä on epänormaali jakauma. Normaalijakauma arvioidaan Shapiro-Wilk-testillä.

Suhteiden erot arvioidaan Fisherin tarkalla testillä tai Chi-neliötestillä; jatkuva muuttujavertailu kolmen ryhmän välillä suoritetaan käyttämällä One-Way Variance Analysis of Analysis (ANOVA) -testiä normaalijakautuneille tiedoille tai Kruskal-Wallis-testillä, jos kyseessä on ei-normaalijakauma.

Molekyylimenetelmien yhteensopivuus perinteisen periprosteettisen kudoksen ja nivelnesteen viljelmän kanssa testataan Choenin kappalla.

Myös kunkin määrityksen herkkyys ja spesifisyys arvioidaan.