Nowe podejścia molekularne do diagnostyki infekcji protez stawów

Pacjenci Do badania zostanie włączonych łącznie 70 pacjentów z Oddziału Chirurgii Rekonstrukcyjnej i Zakażeń Kostno-Stawowych (CRIO) oraz Oddziału Biodrowego IRCCS Ospedale Galeazzi-Sant'Ambrogio z podejrzeniem zakażenia protezy. Każda próbka zostanie poddana analizie zarówno za pomocą tradycyjnej hodowli, jak i sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Na podstawie wyników posiewów pacjenci zostaną podzieleni na 3 grupy.

Pobieranie próbek do analizy molekularnej Próbki tkanki okołoprotezowej z makroskopowymi objawami infekcji zostaną pobrane z błony maziowej, styku kość-proteza oraz kanałów śródszpikowych. Płyn stawowy zostanie sterylnie pobrany do pojemników wolnych od DNazy i RNazy w celu analizy NGS przed wykonaniem artrotomii. Do pobrania próbek z powierzchni styku tkanki z implantem kostnym oraz z kanału szpikowego do analizy NGS zostaną użyte sterylne wymazówki i podkładki. Tkanka kostna zostanie pobrana nowym, sterylnym instrumentarium. Próbki zostaną zamrożone w ciągu 2 godzin od pobrania w temperaturze -80°C do .

Pobranie próbek do hodowli Pobranie próbek tkanek okołoprotezowych i implantu zostanie przeprowadzone w trakcie zabiegu, po odpowiednim odsłonięciu zmienionego miejsca. Płyn maziowy będzie zbierany w sterylnych probówkach z zakrętką. Tkanki okołoprotezowe oraz implant będą pobierane do sterylnych pojemników przy użyciu nowego, sterylnego instrumentarium. Wszystkie próbki zostaną przesłane do Laboratorium w ciągu 2 godzin od pobrania. Próbki po traktowaniu 0,1% (w:v) ditiotreitolem w celu usunięcia bakterii z biofilmu będą hodowane na płytkach agarowych i bulionie dla bakterii tlenowych i beztlenowych przez 15 dni. Identyfikacja drobnoustrojów zostanie przeprowadzona za pomocą testów biochemicznych.

Kolejna próbka tkanki, zebrana w osobnej sterylnej probówce z zakrętką, zostanie użyta do usunięcia DNA gospodarza w celu wyizolowania DNA drobnoustroju dla strzelby NGS. Próbki zostaną poddane działaniu saponiny i/lub różnych dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji DNA drobnoustrojów. dsDNA zostanie określone ilościowo za pomocą fluorometru Qubit, a jego czystość zostanie określona za pomocą spektofotometru nanokropelkowego.

Analiza płynu stawowego Płyn stawowy pod kątem liczby i rozmazu leukocytów będzie zbierany do probówek zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i analizowany za pomocą analizatora hematologicznego Sysmex XN.

Oznaczenie białka maziowego, glukozy, białka C-reaktywnego (CRP) i esterazy leukocytowej zostanie przeprowadzone w płynie maziowym zebranym do probówek zawierających aktywator skrzepu. Oznaczenie białek, glukozy i CRP zostanie wykonane na analizatorze Atellica CH i IM (Siemens), natomiast oznaczenie esterazy leukocytowej za pomocą pasków do analizy moczu.

Analiza molekularna 70 próbek zostanie wysłanych do specjalistycznego laboratorium, które przeprowadzi ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek biologicznych przy użyciu specjalnie dostosowanych, zastrzeżonych technik, które obejmują zatężanie materiału komórkowego, lizę mechaniczną oraz usuwanie inhibitorów organicznych i DNA ludzkiego gospodarza. Aby zapewnić jakość, każda próbka zostanie poddana pozytywnej i negatywnej kontroli ekstrakcji.

Pod koniec badania wszelki pozostały materiał biologiczny zostanie zniszczony

Metodologia statystyczna Wielkość próby Liczebność próby została obliczona biorąc pod uwagę przede wszystkim zgodność innowacyjnej metody molekularnej z tradycyjną hodowlą tkanki okołoprotezowej i mazi stawowej w definiowaniu pacjentów z dodatnim lub ujemnym wynikiem zakażenia protezami stawów. Z doświadczenia badaczy wynika, że ​​odsetek pacjentów poddawanych operacji rewizyjnej z powodu niepowodzenia implantu stawu kolanowego i biodrowego w IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio, u których na podstawie badania kulturowego rozpoznano zakażenie protezy stawu, wynosi 45%. Biorąc pod uwagę margines błędu wynoszący 15%, alfa = 0,05 i moc = 80%, liczba pacjentów do zbadania wynosi 70.

Metodologia analizy Dane kategoryczne będą opisywane jako częstotliwości bezwzględne i względne, natomiast dane ciągłe będą opisywane jako średnia i 95% przedział ufności w przypadku rozkładu normalnego lub jako mediana i rozstęp międzykwartylowy w przypadku rozkładu innego niż normalny. Rozkład normalny zostanie oceniony za pomocą testu Shapiro-Wilka.

Różnice w proporcjach zostaną ocenione za pomocą dokładnego testu Fishera lub testu Chi-kwadrat; ciągłe porównanie zmiennych pomiędzy trzema grupami zostanie przeprowadzone przy użyciu testu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) dla danych o rozkładzie normalnym lub testu Kruskala-Wallisa, w przypadku rozkładu innego niż normalny.

Zgodność metod molekularnych z tradycyjną hodowlą tkanki okołoprotetycznej i mazi stawowej zostanie sprawdzona za pomocą kappy Choena.

Oceniona zostanie również czułość i swoistość każdego testu.